Гистологические красители на основе экстрактов ягод винограда и чёрной смородины

Введение. Антоциановые пигменты широко распространены в растительном мире, где они окрашивают плоды, листья и цветы растений в различные оттенки от розового до чёрно-фиолето- вого цвета. Многочисленные положительные и лечебные эффекты антоцианов, связанные прежде всего с их фотопротекторными и антиоксидантными свойствами, объясняют их использование в качестве натуральных красителей в пищевой (для окраски молочных продуктов, напитков, джемов, конфитюров), косметической и фармацевтической промышленности [1, 2, 3]. Сведений об их использовании в качестве красителей для гистологии немного [4]. В предыдущем исследовании нами был предложен ядерный краситель на основе плодов черноплодной рябины, содержащей значительное количество антоцианов [4]. При этом возник вопрос о возможном получении гистологических красителей на основе других источников антоциан-содержащего растительного сырья.

Цель исследования - получить гистологические красители на основе ягод темного сорта винограда «Изабелла» (Vitis labrusca x Vitis vinifera) и ягод чёрной смородины (Ribes nigrum L.) и разработка общих рекомендаций по приготовлению антоциановых гистологических красителей. Ягоды винограда отличаются высоким содержанием фенольных соединений, к которым относятся и антоцианы (собственно флавоноиды). При этом самое высокое содержание флавоноидов отмечено в ягодах сорта «Изабелла» [1]. Основным красящим веществом является моногликозид энидина энин. В ягодах чёрной смородины среди антоциановых соединений следует отметить 3-гликозиды и 3-рутинозиды дельфинидина и цианидина [2]. Интересно, что энидин винограда является эфиром дельфинидина, а цианидин в большом количестве содержится в плодах черноплодной рябины. Так как агликоны антоцианов растворимы в спирте и не растворимы в воде, в качестве экстрагента красящих веществ в настоящей работе использовался этиловый спирт. По данным других авторов [1, 5] для экстрагирования антоцианов также предпочтительным является этанол. Более того, было показано, что применение этанола в качестве экстрагента в значитель- ной степени увеличивает количество красящих веществ и обеспечивает большую стабильность и максимальную сохранность антоциановых пигментов [6].

Материал и методы исследования. Свежие ягоды винограда (сорт «Изабелла») или чёрной смородины разминают ступкой, заливают 90% этиловым спиртом, плотно закрывают крышкой, оборачивают фольгой и помещают в защищённое от света место. Через 3-4 дня стеклянную банку с плодами помещают в водяную баню при температуре 900 на 15-20 минут. После охлаждения продолжают настаивать в течение нескольких дней (недели). Затем плоды отжимают и получают тёмно-красный непрозрачный спиртовой раствор (рН 0-1), который можно хранить в течение длительного времени. Непосредственно перед окрашиванием добавляют медный купорос из расчёта 2-2,5 грамма медного купороса на 50 мл раствора. При использовании в качестве сырья ягод тёмных сортов винограда, в качестве протравы помимо медного купороса (рис. 1) можно использовать сульфат магния (рис. 2), железный купорос и алюмокалиевые квасцы. Выбор протравных солей в этом случае повлияет на цвет окрашенных структур. В полученный краситель помещают депарафинированные срезы на 15-20 минут. Возможна более длительная экспозиция до 30-40 минут. Интенсивность окрашивания при этом будет ещё выше. После красителя срезы переносят в 70% спирт на 3-5 секунд, затем по два раза в 96% спирт и ксилол на 35-45 секунд и заключают под покровные стёкла.

Результаты исследования и их обсуждение. Ядра клеток и базофильные структуры цитоплазмы окрашиваются в фиолетовый цвет (рис. 1, рис. 3). Хорошо визуализируются глыбки хроматина, ядрышки и кариолемма. При окраске нервной ткани (рис.1, рис. 3) прекрасно идентифицируются цитоархитектонические особенности. Следует отметить высокую избирательность окрашивания. Окраска стойкая. При хранении срезы не обесцвечиваются. Возможно многоразовое использование красящего раствора в течение нескольких недель. Специальных способов фиксации материала не требуется. Для этой цели достаточно стандартного 10% раствора формалина. Цвет окрашенных структур зависит от типа протравной соли. При использовании медного купороса, ядра и базофильные структуры фиолетового цвета (рис. 1, рис. 3), при добавлении сернокислого магния (для экстракта винограда) эти же структуры красно-фиолетового цвета (рис. 2). Следует отметить некоторое преимущество красителя на основе чёрной смородины (рис. 3), возможно, связанное с тем, что дельфинидины чёрной смородины имеют более интенсивный чёрный цвет и обладают высокой стабильностью [2]. Что касается протравных солей, то наилучшие результаты окрашивания наблюдались при использовании медного купороса.

Проведенные эксперименты позволяют предложить следующие рекомендации для получения основных гистологических красителей на основе растений с высоким содержанием антоцианов. Наиболее подходящим сырьём являются свежие мягкие плоды тёмного цвета. Для экстракции лучше использовать 90% этиловый спирт. При этом, чем дольше экстрагирование (от двух до четырёх недель), тем интенсивнее цвет

Рис. 1. Окрашивание красителем на основе экстракта винограда с добавлением медного купороса. А. Срез лёгкого крысы. Б. Срез коры мозжечка крысы. Ув.400.

Рис. 2. Окрашивание красителем на основе экстракта винограда с добавлением сульфата магния.

А. Срез миокарда крысы. Б. Срез головного мозга крысы. Ув.400.

Рис. 3. Окрашивание красителем на основе экстракта чёрной смородины с добавлением медного купороса. А. Срез печени. Б. Срез коры мозжечка. Ув.400.

красителя. В процессе экстракции рекомендуется нагревание в водяной бане (900 в течение 15-20 минут). В полученный после отжима ягод спиртовой раствор перед гистологическим окрашиванием необходимо добавить медный купорос из расчёта 2-2,5 грамма на 50 мл раствора.

Предлагаемый способ подходит для доступного, широко распространённого в ЦентральноЧернозёмном районе растительного сырья, отличается лёгкой экстракцией красящих веществ, простотой приготовления красящего раствора и низкой себестоимостью. Немаловажно, что используются нетоксичные ингредиенты. Получаемые красители могут заменить более дорогие, чаще всего импортируемые аналоги.

Химический механизм предлагаемого способа заключается в реакции комплексообразования, в которой участвуют агликоны антоцианов и соли металлов [7]. В структуре агликонов присутствует положительно заряженный оксониевый атом кислорода, образующий донорно-акцепторную связь с атомами металлов-комплексообразователей (медь, железо и др.). В результате, и атом кислорода, отдавший неподелённую пару электронов, и металл-комплексобразователь оказываются в цепочке сопряжённых связей. При этом металл оказывает воздействие на всю сопряжённую систему своей электронной оболочкой и зарядом ядра [7]. Поэтому в зависимости от типа соли, добавляемой в экстракт, будет отличаться окраска структур, что в настоящей работе наглядно продемонстрировано как для красителя на основе ягод винограда (рис. 1 и рис. 2), так и для красителя на основе чёрной смородины.

Таким образом, для получения ядерных красителей для гистологических целей следует использовать растительное сырьё с высоким содержанием антоцианов. Основный характер получаемых красителей объясняется химической структурой агликонов, в которой присутствует положительно заряженный оксониевый атом кислорода. Благодаря наличию у последнего неподе-ленной пары электронов, агликоны легко вступают в реакции комплексообразования с металлами, в результате чего образуются дополнительные связи между красителем и окрашиваемой тканью.