Гистоморфометрическая характеристика активности дистракционного остеогенеза при различных способах нарушения целостности костей голени (экспериментальное исследование)

В настоящее время одной из актуальных проблем клинической и экспериментальной ортопедии является сокращение сроков госпитализации пациентов без ущерба качеству проведённых лечебных мероприятий и исходу лечения. Предпосылки к решению этой задачи были заложены в работах Г.А. Илизарова и его учеников, постулировавших основные принципы компрессионно-дистракционного остеосинтеза: стабильную фиксацию отломков, стимулирующее влияние напряжения растяжения, сберегательное отношение к остеогенным тканям и кровоснабжению [4, 5, 12, 13, 14]. Во многих работах достаточно полно описано строение дистракционного регенерата [4, 12] и особенности тканевого обмена при активном течении репаративного процесса – высокий уровень оксигенации в обильно васкуляризованной парной зоне неоостеогенеза и состояние гипоксии в гиповаскулярной соединительнотканной прослойке [8]. При этом большое внимание уделяется кровоснабжению кости как в преддистрак-ционном периоде, так и в течение периода дистракции [3, 12, 21]. Биомеханическое моделирование процесса репаративной регенерации кости, учитывающее происхождение остеогенных клеток, выявляет первоочередную роль костного мозга в качестве источника малодифференцированных клеток с высокой остеогенной активностью [19]. Оптимальное сочетание стабильной фиксации и сохранности костного мозга отломков, адекватного кровоснабжения дистракционного регенерата обеспечивает органотипическую перестройку новообразованного участка кости [5, 10, 12, 14, 17, 20, 22, 23]. В экспериментальном отделе РНЦ «ВТО» разра- ботан ряд моделей дистракционного остеосинтеза длинных трубчатых костей с целью изучения закономерностей формирования дистракционного регенерата [1, 6, 9, 15, 18]. Обеспечивая одинаково стабильную фиксацию костных фрагментов, они различаются между собой способом нарушения целостности кости в области диафиза и, следовательно, степенью травмати-зации костного мозга и сосудистой сети органа [6, 10, 14, 16].

Целью настоящей работы являлась гистологическая и морфометрическая оценка активности остеогенеза при формировании дистракционного регенерата большеберцовой кости после нарушения её целостности различными способами, а также разработка гистоморфометриче-ского критерия, позволяющего по результатам количественной оценки костеобразования в периоде дистракции прогнозировать исход эксперимента.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были дистракционные регенераты и прилежащие к ним отломки большеберцовых костей, взятые у 25 взрослых беспородных животных (собаки) на различных сроках эксперимента, и диафизы большеберцовых костей 4 интактных животных (норма).

В первой серии производили безударную кортикотомию берцовых костей в средней трети диафиза, во второй – частичную косую кортико-томию берцовых костей в средней трети с последующей торсией, в третьей – остеотомию долотом на том же уровне. Отломки большеберцовой кости фиксировали аппаратом Илизарова и через 5 суток начинали удлинение голени с темпом 1 мм в сутки (за 4 приема). Удлинение осуществляли в течение 4 недель. Животных выводили из эксперимента через 33, 63 и 93 дня (по окончании 28 суток периода дистракции, 30 – периода фиксации аппаратом и 30 – после снятия аппарата).

Материалом исследования явились продольные гистотопографические целлоидиновые срезы, выполненные во фронтальной плоскости, окрашенные гематоксилином и эозином, пикро-фуксином по методу Ван-Гизона.

Были использованы гистологический, морфометрический, статистический методы исследования. Гистоморфометрические исследования выполняли на аппаратно-программном ком- плексе "ДиаМорф". Для оценки значимости межгрупповых различий использовали критерии Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни.

При выполнении количественного исследования по изучению остеогенной активности использовали способ, предложенный и апробированный авторами (заявка на выдачу патента РФ № 2001110381/14 приоритет от 16.04.2001), предусматривающий комплексную оценку образования костного вещества в процессе формирования и перестройки дистракционных регенератов [11].

Статистически обработанные количественные данные использовали для расчета следующих параметров: коэффициента формы регенерата (Кф), коэффициента структуры регенерата (Кс), коэффициента компактизации регенерата (Кк), индекса плотности компактной костной ткани (Икк), индекса плотности губчатой костной ткани ( Игк) . Представленные выше параметры являлись базовыми и на их основе вычислялись показатели, позволяющие охарактеризовать состояние костеобразования: индекс содержания костного вещества в интактной кости (Ии) и индекс содержания костного вещества в регенерате (Ир). Значения базовых параметров, использованных для вычисления индексов содержания костного вещества, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Значения базовых параметров для гистоморфометрической оценки активности дистракционного остеогенеза

Способ нарушения целостности диафиза большеберцовой кости	Срок эксперимента (сутки)	Кф	Кс	Игк (%)	Кк	Икк(%)
Безударная кортикотомия долотом с торсией Z-образной спицей	33	1,04 ± 0,029	0,72 ± 0,021*	52,2 ± 1,74*	---	---
	63	1,01 ± 0,044	0,91 ± 0,037**	31,9 ± 2,90*	0,06 ± 0,019*	83 ± 2,1**
	93	1,17 ± 0,022**	0,94 ± 0,040**	23,2 ± 2,61*	0,25 ± 0,013*	84 ± 2,0**
Косая кортикотомия долотом с торсией Z-образной спицей	33	1,01 ± 0,013	0,81 ± 0,017**	34,8 ± 2,61*	---	---
	63	1,10 ± 0,025*	0,84 ± 0,015**	35,4 ± 3,48*	0,03 ± 0,018*	79 ± 1,4**
	93	1,10 ± 0,029*	0,91 ± 0,014*, р < 0,04	23,8 ± 2,61*	0,23 ± 0,08*	80 ± 1,5**
Остеотомия долотом с повреждением питающей артерии	33	0,97 ± 0,040	0,58 ± 0,005*	36,5 ± 3,40**	---	---
	63	1,10 ± 0,140	0,76 ± 0,030*	34,0 ± 5,70**	---	---
Контрольная группа		1,00 ± 0,012	1,00 ± 0,012	0,09 ± 0,0035	0,43 ± 0,012	99 ± 0,001

Примечание: * – достоверность межгрупповых различий и различий с контролем, р < 0,01; ** – достоверность различий с контролем р < 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования были определены группы с оптимальным, удовлетворительным и неудовлетворительным течением репаративного процесса.

Нарушение целостности большеберцовой кости с применением способа безударной кортикото-мии обеспечивало наиболее благоприятные условия для остеогенеза в период дистракции, поскольку в этом случае сохранялись как внутрикостная сосудистая сеть отломков, так и кровоснабжение со стороны надкостницы. По данным микроскопического исследования, питательная артерия прослеживалась на всем протяжении новообразованного участка диафиза у всех экспериментальных животных данной серии.

В период дистракции остеосинтетический процесс преобладал над резорбтивным (рис. 4а), площадь костных отделов составляла не менее 70% от площади всего регенерата на гистологических препаратах. Трабекулярная плотность эндостально образованной губчатой кости превышала 35%. Немаловажно, что к концу периода дистракции наблюдался активный остеогенез на кортикотомированных поверхностях костных отломков в интермедиарной зоне. Это свидетельствовало о сохранении кровоснабжения компактной кости отломков и обеспечивало раннее формирование корковой пластинки дистракционного регенерата (рис. 1а). Ир к этому сроку составлял не менее 90% от нормы (без учета типа костной ткани) (рис. 5).

б

а

в

Рис. 1. Гистотопографические препараты дистракционных регенератов диафиза большеберцовой кости, срок эксперимента 33 дня (28 суток периода дистракции): а – серия с безударной кортикотомией; б – серия с частичной косой кортикотомией и последующей торсией; в – серия с остеотомией долотом; окр. пикрофуксином по Ван-Гизону, сканограммы

Период фиксации характеризовался закрытием «зоны роста», формированием корковой пластинки и образованием костномозговой полости, что сопровождалось резорбцией значительного объёма трабекул губчатой кости (рис. 2а). Морфологическую картину подтверждали количественные данные, свидетельствующие об увеличении площади костных отделов до 91%, с одной стороны, и о снижении плотности губчатой кости до 23% - с другой. Ир в этом периоде составлял 79% от нормы (рис. 5).

б

а

в

Рис. 2. Гистотопографические препараты дистракционных регенератов диафиза большеберцовой кости, срок эксперимента 63 дня (30 суток периода фиксации апаратом): а - серия с безударной корти-котомией; б - серия с частичной косой кортикото-мией и последующей торсией; в - серия с остеотомией долотом; окр. пикрофуксином по Ван-Гизону, сканограммы

В период после снятия аппарата под влиянием функциональной нагрузки происходило ремоделирование дистракционного регенерата с преобладанием остеогенной активности. В то же время не отмечалось явления гиперостоза, возникающего при функциональном перенапряжении в результате несоответствия структуры костного органа (рис. 3а) [2]. Ир через месяц после снятия аппарата составлял более 95% от нормы (рис. 5).

В серии с выполнением частичной косой кортикотомии берцовых костей в средней трети с последующей торсией сосудистая сеть диафиза большеберцовой кости повреждалась как в результате ударной контузии, так и вследствие травматизации костного мозга и надкостницы вдоль значительной по протяженности линии излома. Питательная артерия прослеживалась на всем протяжении диафиза.

а б

Рис. 3. Гистотопографические препараты дистракционных регенератов диафиза большеберцовой кости, срок эксперимента 93 дня (30 суток периода после снятия аппарата): а – серия с безударной корти-котомией; б – серия с частичной косой кортикото-мией и последующей торсией; окр. пикрофуксином по Ван-Гизону, сканограммы

В конце периода дистракции, наряду с активным костеобразованием и умеренной остео-кластической резорбцией в апикальных участках костных отделов (рис. 4б), площадь которых составляла не менее 80% от площади регенерата, наблюдали интенсивную резорбцию трабекул в базилярных участках. Это определяло снижение плотности губчатой кости в сравнении с аналогичным сроком предыдущей серии (не более 25%). Ир также был снижен и состав- лял около 65% от нормы (рис. 5). Следствием травматизации сосудов компактной кости являлось угнетение остеогенеза на их раневой поверхности, а также остеопороз и выраженная периостальная реакция в отломках (рис. 1б).

В период фиксации аппаратом, в результате ухудшения кровоснабжения «зоны роста», обусловленного редуцированием венозного и капиллярного отделов сосудистого русла, процесс остеогенеза замедлялся. Резко снижался темп прироста площади костных отделов, составлявших 84% от всего регенерата, трабекулярный объем губчатой кости сохранялся на уровне 25%. Гипоксия отдельных участков являлась причиной дифференцировки остеогенных клеток по хондроидному типу. Ир к окончанию периода составлял 79% от нормы (рис. 5). Ин-термедиарное пространство было заполнено преимущественно зрелой губчатой костной тканью, образованной как эндостально, так и пе-риостально. Таким образом, к этому сроку не произошло органотипической перестройки новообразованного участка диафиза, продолжался процесс накопления массы костного вещества (рис. 2б).

В период после снятия аппарата функциональная нагрузка стимулировала перестройку регенерата. Так, через 30 суток после снятия аппарата наблюдали корковую пластинку, формирующуюся в результате компактизации губчатой кости регенерата, и разреженную сеть трабекул в центральной его части (рис. 3б). Ир составлял около 87% от нормы, что свидетельствовало о меньшей зрелости новообразованного участка, чем к тому же сроку эксперимента в предыдущей серии (рис. 5).

а б в

Рис. 4. Апикальные участки костных отделов дистракционных регенератов, срок эксперимента 33 дня (28 суток периода дистракции): а – серия с безударной кортикотомией; б – серия с частичной косой кортикотомией и последующей торсией; в – серия с остеотомией долотом, окр. гематоксилином-эозином, ув. об. 6,3, ок. 10. Стрелками указаны остеокласты, располагающиеся на поверхности новообразованных костных трабекул

Наиболее неблагоприятной в отношении сохранения сосудистой сети являлась остеотомия долотом в тех случаях, когда полностью пересекалась костномозговая полость, что подтверждено гистологическими исследованиями. Такие данные получены при изучении диафизов большеберцовых костей у животных, выведенных из эксперимента по окончании периодов дистракции и фиксации голени в аппарате. У двух животных, выведенных из опыта в период после снятия аппарата, при выполнении остеотомии не наблюдалось кровотечения из операционной раны, что свидетельствовало о сохранении внутрикостного кровоснабжения и было подтверждено гистологически.

Низкий уровень остеогенной активности и резорбция новообразованных трабекул в период дистракции (рис. 4в) обусловливали резкое уменьшение площади костных отделов регенерата по сравнению с тем же периодом предыдущих серий – в среднем около 60% (рис. 1в). Плотность губчатой костной ткани составляла около 25%. В составе трабекул встречались многочисленные участки хондроидной ткани, что свидетельствовало об их недостаточном кровоснабжении. Ир в этом случае составлял менее 50% от нормы (рис. 5).

срок эксперимента (сутки)

□ остеотомия долотом о косая корикотомия с торсией z-образной спицей о безударная кортикотомия

Рис. 5. Индекс содержания костного вещества в регенерате (Ир) в процентах от нормы (Ии)

В период фиксации репаративный процесс протекал по-разному. В одном случае, при сохранении фиброзированной соединительнотканной прослойки, костные отделы рарефици-ровались (рис. 2в), плотность губчатой кости составляла всего 16%. В другом случае внутри фиброзного «чехла», располагавшегося по периферии всего новообразованного участка, костные отделы разделяла зона хондроидной ткани. Плотность губчатой кости в этом случае была выше и составляла 33%. В обоих случаях Ир был ниже, чем в те же сроки для предыдущих серий, и в среднем составлял 68% (рис 5). Признаков формирования корковой пластинки на уровне регенерата к этому сроку не наблюдалось. Поскольку в толще «зоны роста» не было отмечено очагов остеогенеза, следует отметить необходимость продления периода фиксации для данной экспериментальной серии. Это озна- чает, что сроки оганотипической перестройки новообразованного участка диафиза также должны были увеличиться [7].

Неожиданно раннее «созревание» регенерата, наблюдаемое к 30 суткам периода после снятия аппарата, можно объяснить сохранением питательной артерии у животных, выведенных из эксперимента в этом периоде. Новообразованный участок диафиза был представлен зрелой губчатой костной тканью, компактизирую-щейся по периферии.

Анализ полученных данных позволяет сделать следующие выводы:

• -    при проведении дистракционного остеосинтеза длинных трубчатых костей в условиях стабильной фиксации отломков эффективность репаративного процесса зависит от степени травматизации отломков, в первую очередь – от сохранности кровоснабжения кости;

• -    определяющим показателем интенсивности репаративного остеогенеза является накопление костного вещества в регенерате в период дистракции;

• -    индекс содержания костного вещества является информативным показателем, позволяющим количественно оценивать эффективность дистракционного остеогенеза при исследовании гистологического материала.

Наиболее благоприятное течение репаративного процесса в период дистракции при удлинении большеберцовой кости в области диафиза после выполнения безударной кортикотомии характеризуется накоплением костного вещества в объёме, составляющем не менее 90% от такового у интактного животного. В период фиксации аппаратом «зона роста» регенерата замещается губчатой костной тканью. Через 30 суток после снятия аппарата под влиянием физиологических нагрузок формируются костномозговая полость и компактная корковая пластинка.

Удовлетворительный результат наблюдается в эксперименте с выполнением частичной косой кортикотомии берцовых костей в средней трети с последующей торсией. Накопление костного вещества к окончанию периода дистракции превышает 65% от нормы. В период фиксации аппаратом в «зоне роста» сохраняются отдельные участки плотной волокнистой соединительной ткани. Спустя 30 суток периода после снятия аппарата формирующаяся корковая пластинка имеет строение губчатой кости, костномозговая полость находится в начальной стадии формирования.

При неудовлетворительном течении дистракционного остеосинтеза, после выполнения остотомии берцовых костей долотом, объём костного вещества к окончанию периода удлинения не превышает 50% от нормы. К 30 суткам периода фиксации аппаратом «зона роста» реге- нерата представлена фиброзной либо хондроид-       сти этого периода и замедляет восстановление ной тканью, корковая пластинка не сформиро-       органотипического строения кости.

вана, что требует увеличения продолжительно-