Gliocladium roseum и Trichoderma viride как биодеструкторы афлатоксина В1 и антагонисты токсигенного гриба Aspergillus flavus

Контаминация фуражного зерна и растительного сырья афлатоксинами — вторичными метаболитами аспергилловых грибов представляет собой серьезную проблему. Из-за гепатотоксичности, канцерогености и тератогенности афлатоксины опасны для подавляющего большинства теплокровных (1), поэтому загрязнение ими кормов может быть причиной гибели или снижения продуктивности животных, а также приводить к попаданию токсинов в пищевые продукты (2). В связи с повсеместным распространением аспергиллов, их способностью развиваться как факультативные паразиты на вегетирующих растениях и в то же время вести сапро-трофный образ жизни практически невозможно полностью исключить вероятность контаминации зерна и кормовых трав продуцентами афлатоксинов во время сбора урожая и при его хранении. Поэтому подходы к решению рассматриваемой проблемы в основном направлены на деконтаминацию уже загрязненного токсинами сырья (3, 4) или биоконтроль потенциально афлатоксигенных видов Aspergillium , в частности Aspergillus flavus , микробными антагонистами (5). Из-за высокой стабильности афлатоксинов деконтаминацию с применением химических или физических методов обработки проводят в жестких условиях (6, 7). Это зачастую снижает качество кормов и делает такую обработку экономически невыгодной. Биологический способ деконтаминации (8-10) связан с использованием токсичных

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (соглашение ¹ 14-16-00150).

для A. flavus вторичных метаболитов некоторых растений (11), а также с поиском природных ингибиторов афлатоксиногенеза и микроорганизмов-деструкторов, которые могли бы служить источником ферментов, разлагающих афлатоксины или трансформирующих их до неопасных производных (12-16). Например, у ряда микромицетов, колонизирующих природные субстраты совместно с токсигенными изолятами A. flavus , типичный для этого гриба афлатоксин В1 (АФВ1) разлагается в культуральной жидкости (КЖ) (17). Подтверждена ферментативная природа детоксицирующей активности КЖ одного из таких биодеструкторов — Phoma glomerata (штамм PG41) (18).

В представленной здесь работе способность разлагать АФВ1 впервые исследована у двух других микромицетов ( G. roseum и T. viride ), ранее выделенных нами из консцорциума токсигенного A. flavus , с целью оценки перспектив их использования в качестве как источников ферментов, ката-болизирующих АФВ1, так и антагонистов его продуцента.

Методика. Деструктурирующую активность штаммов GRZ7 ( Glio-cladium roseum Bainier) и TV35 ( Trichoderma viride Pers.) из рабочей коллекции лаборатории патофитофизиологии (Всероссийский НИИ фитопатологии) оценивали, культивируя при 28 ° С с аэрацией (Excella TM E-25/25R, «New Brunswick Scientific Co., Inc.», США; 200 об/мин) в течение 7 сут на жидкой среде Чапека с гидролизатом казеина (Ч+ГК), в которую перед внесением инокулюма грибов стерильно вносили АФВ1 («Sigma», США) до конечной концентрации 5-10 мкг/мл. Высокомолекулярные метаболиты с номинально отсекаемой молекулярной массой >  5 кДа получали из КЖ G. roseum , выращенного при тех же условиях в отсутствие токсина (интактная КЖ), с помощью преципитации фильтрата сульфатом аммония и последующего ультрафильтрационного фракционирования водного раствора преципитата. АФВ1 добавляли в стерильные образцы высокомолекулярной фракции и инкубировали смесь при 27-28 ° С в течение 3 сут. Остаточные количества В1 в КЖ грибов или в образцах фракции определяли, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (18).

Влияние T. viride и G. roseum на рост токсигенного A. flavus (штамм А11) исследовали методом двойных культур (картофельно-глюкозный агар, 20-22 ° С, 6 сут). Измеряли минимальный и максимальный диаметры и рассчитывали площадь колоний, используя значения максимального диаметра. Контрольные культуры штамма А11 выращивали при тех же условиях в отсутствие предполагаемых антагонистов.

Статистическую обработку данных проводили в программе Statis-tiсa 6.0 («StatSoft», США). Достоверность различий между контролем и вариантами опыта подтверждали с помощью t -теста для независимых переменных (p <  0,05). В таблице и на рисунке приведены значения среднего ( M ) и стандартной ошибки среднего ( m ). Каждый эксперимент включал не менее 6 повторностей с 3-кратным воспроизведением.

Результаты . Изучение динамики разрушения афлатоксина грибом G. roseum показало, что уже через 3 сут его выращивания на среде с АФВ1 содержание последнего в КЖ сокращалось вдвое, а к концу культивирования не превышало 10-20 % от внесенного количества (рис., кривая 4). Значительное снижение концентрации АФВ1 отмечали и после его инкубации во фракции высокомолекулярных метаболитов, выделенных из фильтрата интактной КЖ G. roseum (см. рис., кривая 5). Термическая обработка фракции приводила к потере токсин-деградирующей активности (см. рис., кривая 1). Полученные результаты позволяют предполагать, что у этого биодеструктора, так же как у P. glomerata (18) или других аскомицетов (12, 19), в разложении АФВ1 могут принимать участие экстрацеллюлярные фермен-947

ты. Ранее было установлено, что G. roseum секретирует зеараленон-специ-фичную лактоназу (20), которая гидролизует лактонное кольцо в молекуле этого опасного для млекопитающих микотоксина фузариевых грибов, снижая тем самым его токсичность (21). Способность зеараленона ингибировать рост большинства микромицетов значительно ограничивает возможность применения грибов-антагонистов против заселяющих растительное сырье токсигенных фузариев, однако G. roseum не чувствителен к его действию (20). Как и в случае зеараленона, лактонное кольцо — один из структурных компонентов молекулы афлатоксина В1, с которым связывают его токсичность, мутагенный и канцерогенный эффекты (22-25). Афлатоксин-деградирующая активность, обнаруженная нами у G. roseum , делает его еще более привлекательным с точки зрения использования в качестве биоагента против грибов, продуцирующих микотоксины разной химической природы.

Динамика биодеградации афлатоксина В1 (АФВ1) микромицетами Gliocladium rose-um GRZ7 (4) и Trichoderma viride TV35 (2, 3), культивируемыми на среде с афлатоксином, а также нативными (5) или инактивированными нагреванием (1) высокомолекулярными внеклеточными метаболитами G. roseum. Контроли: для 2, 3, 4 — содержание АФВ1 в питательной среде, не инокулированной микромицетами; для 1, 5 — количество АФВ1, извлеченного из соответствующей фракции метаболитов сразу же после его добавления (без инкубации). Отличия от контроля достоверны при Р ≤ 0,05; Y-погрешности показывают стандартную ошибку среднего для 3 опытов при 6 повторах на вариант в каждом.

Деструктурирующая активность исследованного нами штамма T. viride была невысока. Утилизация АФВ1 из питательной среды происходила медленно, и его концентрация в КЖ по мере роста гриба снижалась незначительно (см. рис., кривая 2). Однако способность штамма к деструкции АФВ1 возрастала (кривая 3), если для засева жидкой среды использовали суспензию спор гриба, предварительно выращенного на агаризован-ной среде Ч+ГК, в которую был добавлен АФВ1 (0,9 мкг/мл). При использовании такого инокулюма доля деструктурированного токсина в погруженной культуре увеличивалась к концу ферментации на 20 % (р = 0,03). Из этого следует, что обнаруженная нами у T. viride АФВ1-деградирующая активность индуцибельна и может быть увеличена посредством мутагенеза и последующего отбора наиболее эффективных клонов. Кроме того, исследуемый штамм T. viride оказался эффективным антагонистом A. flavus . При культивировании токсигенного штамма А11 совместно с T. viride наблюдалось значительное торможение роста продуцента афлатоксина (табл.) с сокращением размера колоний в среднем на 64 %.

Радиальный рост токсигенного штамма А11 гриба Aspergillus flavus в индивидуальной культуре и при выращивании совместно с Trichoderma viride TV35 ( Tv ) или Gliocladium roseum GRZ7 ( Gr ) ( M ± m )

Микопаразит G. roseum не оказывал заметного влияния на радиальный рост A. flavus , тем не менее, отличия от контроля были достоверны 948

(табл.), а к концу периода совместного культивирования в некоторых случаях отмечалось обрастание колоний штамма А11 мицелием глиокладиу-ма, что могло быть признаком гиперпаразитизма.

Таким образом, установлено, что исследованные штаммы Tricho-derma viride и Gliocladium roseum (виды-антагонисты многих патогенных грибов), конкурирующие с Aspergillus flavus за природные субстраты, in vitro различались по активности деградации афлатокcина B1 и способности ингибировать рост афлатоксигенного штамма A. flavus . Кроме того, обнаруженная нами возможность индуцирования деструктурирующей активности представляет несомненный интерес в теоретическом и практическом аспекте. Полученные результаты могут быть использованы при создании технологий биологической деконтаминации кормов, загрязненных как афлатоксином В1, так и его продуцентом. При этом G. roseum , по-видимому, может служить источником ферментов, разлагающих этот микотоксин, а T. viride — биоагентом, сдерживающим развитие продуцента.