Характеристика аллелофонда романовской породы овец по гену прионового белка, ассоциированного с генетической устойчивостью к скрепи

Сохранение уникального генофонда автохтонных пород России при их гармоничной интеграции в селекционный процесс с учетом мировых трендов в животноводстве — актуальная задача современной биологической науки (1-3). Животноводческая продукция, получаемая от таких пород, представляет интерес для нутрициологии и перерабатывающей промышленности. Романовская порода — уникальная российская аутен-

Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 14-3600039) и Федерального агентства научных организаций (тема ¹ 0600-2014-0004.3). В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» (ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста).

тичная порода, представляющая одно из отродий северных короткохвостых овец (4, 5). Самобытность романовской породы обусловлена сочетанием непревзойденных качеств шубных овчин с феноменальной (до 10 ягнят) плодовитостью и полиэстричностью (6). История создания породы берет начало в XVII веке, впервые она упоминается в 1802 году (6). Сто лет назад грубошерстное овцеводство, сохраняемое в полунатуральных крестьянских хозяйствах, не только удовлетворяло потребности крестьян в шерсти и мясе, но и давало продукцию на экспорт (7). Признанный классик зоотехнической науки П.Н. Кулешов, обеспокоенный сокращением поголовья овец в России в начале прошлого века, предлагал наметить овцеводческие районы, среди которых на первое место ставил «овчинный район короткохвостой овцы с романовской в центре» (5). В настоящее время генофонд романовских овец рассматривается как важный резерв для создания новых стад, линий, типов многоплодных овец разного направления продуктивности.

Губчатая энцефалопатия овец, известная также под названием скрепи, — одно из заболеваний, способных нанести серьезный экономический ущерб овцеводству. Скрепи — фатальное нейродегенеративное заболевание, поражающее овец и коз, и относящееся к классу трансмиссивных губчатых энцефалопатий (transmissible spongiform encephalopathy, TSE). В эту группу входит также губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (bovine spongiform encephalopathy, BSE). Причиной TSE становится наличие инфекционных патогенов — прионов, которые не имеют нуклеиновых кислот и, по всей видимости, состоят исключительно из модифицированного белка (PrP^Sc). Нормальный клеточный PrP (PrP^C) конвертируется в PrP^Sc посредством посттрансляционного процесса, результатом которого становится высокое содержание β -листов (8). Установлено, что устойчивость к скрепи у овец обусловлена главным образом полиморфизмом гена прионового белка ( PRNP ), кодирующего нормальный PrP^C. С резистентностью или чувствительностью овец к классической скрепи ассоциированы три мутации в аминокислотных кодонах 136 (A/V), 154 (R/H) и 171 (R/Q/H) (9-13).

Основные пять аминокислот (АК), кодирующих три знаковых кодона 136/154/171, предопределяют формирование 15 возможных генотипов PRNP (14, 15). Желательным с точки зрения устойчивости к скрепи считается гаплотип А¹³⁶R¹⁵⁴R¹⁷¹, обозначаемый ARR. В зависимости от генотипа по PRNP различают пять классов генетической устойчивости к скрепи, получивших название по мере снижения устойчивости от G1 до G5. К классу G1 относится наиболее предпочтительный генотип ARR/ARR. Среди десятков тысяч генотипированных овец класса G1 за последние 25 лет не было диагностировано ни одного случая заболевания классической скрепи (16, 17). Однако успешная передача BSE прионов овцам с генотипом ARR/ARR посредством внутримозговой инокуляции показала, что устойчивость этого генотипа к TSE агентам не абсолютная (18). Следует также указать на два диагностированных в Германии случая заболевания овец с генотипом ARR/ARR энцефалопатией, которая по характеристикам подобна классической форме скрепи (15).

Животные с генотипами ARR/AHQ, ARR/ARH, ARR/ARQ генетически устойчивы к скрепи. В целях исключения чувствительности к этому заболеванию у потомства они могут использоваться в селекции только при контроле подборов (G2). Особи с генотипами ARQ/ARQ (дикий тип), ARQ/ARH, ARQ/AHQ, AHQ/AHQ, ARH/ARH и AHQ/ARH (класс G3) обладают низкой генетической устойчивостью, однако при спаривании с 1158

животными G1 дают устойчивое потомство. Носители генотипов ARR/VRQ (G4) и VRQ/AHQ, VRQ/ARH, VRQ/ARQ, VRQ/VRQ (G5) чувствительны к скрепи и должны исключаться из воспроизводства. Показано, что на устойчивость к прионовому протеину и BSE могут влиять иные аминокислотные полиморфизмы, в частности в позициях 101, 112, 143, 172, 175 и 176, большинство из которых встречаются с низкой (< 5 %) частотой (19). Описан октопептидный полиморфизм, проявляющийся в разном числе повторов восьми аминокислот P(Q/H)GGGWGQ, расположенных на N-терминальном конце. Число повторов у крупного рогатого скота, овец и коз варьирует как между, так и внутри видов, изменяясь от двух до пяти (20, 21). Выявлены полиморфизмы PRNP в трех позициях в про-моторной области (C5354A, T5382C и C5622G), при этом два последних полиморфизма могут оказывать существенное влияние на свойства факторов транскрипции (22, 23).

Открытие так называемой атипичной скрепи показало возможность передачи BSE животным различных классов устойчивости, включая G1 (генотип ARR/ARR). Впервые атипичная скрепи была обнаружена у норвежских овец в 2003 году и получила название Nor98 (24). В дальнейшем высокую заболеваемость атипичной скрепи установили в Германии и Франции (25). В Великобритании на атипичные случаи в 2005 году приходилось 37 % от общего числа овец, заболевших скрепи (26). Атипичная и классическая скрепи различаются по ряду важных признаков. Заболевание атипичной формой происходит в более позднем возрасте (4 года и старше), часто в инфицированном стаде обнаруживаются только отдельные заболевшие особи (27). В отличие от патологии классической скрепи, при атипичной форме лишь в редких случаях или вообще не наблюдается нейрональная вакуолизация или наличие иммуногистохомически детектируемого PrPSc в мозге (24). Аномальный PrP в атипичных случаях характеризуется большей чувствительностью к энзиматическому расщеплению по сравнению с классической формой (28). Исследования показали, что при заболевании атипичной формой Nor98 возрастает роль четвертой аминокислоты в знаковых АК кодонах 136/141/154/172 в позиции 141 (L/F). Большинство случаев атипичной скрепи были выявлено среди животных с низкой чувствительностью к классической скрепи (классы G1-G3) (28-30).

С обнаружением стойкой генетической резистентности у овец определенных генотипов по PRNP к классической скрепи и с выявлением природы атипичной скрепи (24) появилась возможность использовать полиморфизм PRNP в качестве дополнительного критерия в селекционных программах, достигая баланса между генетическим разнообразием популяций и возможностью превентивных мер в борьбе со скрепи.

Изучение овец романовской породы на ограниченной выборке показало невысокую генетическую устойчивость к классической скрепи (31). Однако исследованные стада имели в основном вторичное происхождение и были сформированы посредством завоза лимитированного числа линий. Следовательно, полученные данные не позволяют судить об аллелофонде породы. Исследования на устойчивость романовских овец к атипичной скрепи до настоящего времени не проводились.

Животные из генофондных стад Ярославской области могут быть наиболее яркой моделью, отражающей все генетическое разнообразие ал-лелофонда романовской породы. Для проверки гипотезы о том, что алле-лофонд вторично натурализованных стад этой породы, сформированных посредством завоза ограниченного числа линий и находящихся под давлением иных факторов отбора, нетипичен для породы в целом, актуально 1159

включение таких животных в исследование.

Нами впервые проанализирован генетический полиморфизм популяций романовских овец ( Ovis aries ) в АК позиции 141 гена PRNP и определена их восприимчивость к атипичному прионовому белку Nor98.

Целью работы было изучение аллелофонда овец романовской породы по гену прионового протеина, ассоциированного с устойчивостью к классической и атипичной формам скрепи, на исторических территориях формирования породы и в местах ее вторичной натурализации.

Методика. Биоматериалом служили пробы ткани (ушной выщип, кровь) от 364 предварительно здоровых овец романовской породы, архивированные в 2013-2016 годах. Были изучены три популяции из Ярославской области, содержавшиеся в ООО «Авангард» (Pop_1, n = 168), ООО «Агрофима Земледелец» (Pop_2, n = 98) и ООО «Заречье» (Pop_3, n = 46), и одна популяция, интродуцированная для разведения на территории Камчатского края в ОАО «Камчатагроплемсервис» (Pop_4, n = 52).

ДНК выделяли с использованием колонок Nexttec («Nexttec GmbH», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Постановку ПЦР осуществляли по методике Н.А. Зиновьевой с соавт. (32). Реакции проводили согласно протоколу, изложенному Е.А. Гладырь с соавт. (33). Идентификацию аллелей в кодонах 136 (A/T/V), 141 (L/F), 154 (R/H) и 171 (Q/R/H/K) выполняли пиросеквенированием на приборе PSQ96MA («Qiagen», США).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ PSQ96MA SNP Software v.2.0, Microsoft Excel, GenAlEx 6.501.

Результаты. Исследования показали наличие в романовской породе четырех гаплотипов (ARR, ARQ, AHQ, VRQ) и девяти генотипов PRNP (ARR/ARR, ARR/ARQ, ARR/AHQ, ARQ/ARQ, AHQ/ARQ, AHQ/AHQ, ARR/VRQ, VRQ/AHQ, ARQ/VRQ), относящихся ко всем пяти классам генетической устойчивости к классической скрепи. При этом наблюдались различия в распределении гаплотипов и генотипов между группами. Наиболее распространенным оказался гаплотип дикого типа ARQ, кото-

Распределение гаплотипов PRNP ARR (а) , ARQ (б) , AHQ (в) , VRQ (г) , ассоциированных с устойчивостью к классической форме скрепи, в популяциях овец романовской породы: Pop_1 — ООО «Авангард», Pop_2 — ООО «Агрофима Земледелец», Pop_3 — ООО «Заречье» (Ярославская обл.); Pop_4 — ОАО «Камчатагроплемсервис» (Камчатский край).

при этом его частота была относительно низкой 0,022 (Pop_3) (рис.).

рый встречался с частотой от 0,704 в Pop_1 до 0,933 в Pop_4. Во всех группах был выявлен желательный гаплотип ARR, частота которого варьировала от 0,022 в Pop_3 до 0,089 в Pop_1 и в среднем составляла 0,066. Нежелательный гаплотип VRQ встречался в трех из четырех групп (исключение — Pop_1), — от 0,011 (Pop_2) до

Наиболее часто во всех популяциях, как и прогнозировалось, встречался генотип дикого типа ARQ/ARQ, относящийся к классу устойчивости G3 (табл.). Вероятно, это обусловлено длительным разведением породы «в себе», направленным исключительно на закрепление ее уникальных адаптационных и продуктивных качеств. Отмечалась очень низкая частота генотипа ARR/ARR, наиболее устойчивого к классической форме скрепи. Доля животных, несущих генотипы класса G2, различалась между стадами даже в пределах одного региона более чем в 8 раз. По всей видимости, это было связано с преимущественным использованием баранов-производителей разных линий.

В целом исследованная выборка романовских овец характеризовалась относительно невысокими частотами генотипов, относящихся к генетическим классам G4 и G5 и обусловливающих высокий риск заболевания классической скрепи. Такие генотипы были выявлены в трех из четырех популяций с частотой от 2,2 до 4,1 %.

Распределение генотипов по гену прионового белка PRNP (Г) и классов (К) устойчивости к классической форме скрепи в популяциях овец романовской породы

Генотип 136/154/171	Частота
	Pop_1	Po	_2	Pop	_3	Pop	_4	В среднем
	Г    К	Г	К	Г	К	Г	К	Г     К
ARR/ARR       –     –   0,010 ARR/ARQ      0,143 1       0,061 ARR/AHQ      0,066   0,208     – ARQ/ARQ      0,446         0,592 AHQ/ARQ      0,316  0,792  0,265 AHQ/AHQ     0,030         0,031 ARR/VRQ      –    –    – VRQ/AHQ       –  1       0,031 VRQ/ARQ       –  J       0,010 П р и м е ч а н и е. Описание популяций ветствующего генотипа в исследуемых по			Класс G1 0,010     – Класс G2 - 0,061     0,0 – 22 Класс G3 0,609 0,888    0,282 0,043 Класс G4 –     0,022 Класс G5 0,041     0,022 см. в разделе «Ме пуляциях.		0,022     0,0 – 58 0,865 0,934    0,039 0,022     – - 0,022     0,038 тодика». Прочерки		–      0,003    0,003 0,058     0 0 , , 0 0 9 3 3 0 J 0,123 0,566 0,904    0,258    0,852 0,028 –      0,003    0,003 - 0,038      00,,001081   1 0,019 означают отсутствие соот-

Мы впервые оценили генетический статус романовской породы по предрасположенности к инфицированию атипичным прионовым белком Nor98. В результате выявили совокупно пять различных гаплотипов — ALRR, ALRQ, ALHQ, VLRQ и AFRQ, а также десять генотипов PRNP (136/141/154/171) — ALRR/ALRR, ALRR/ALRQ, ALRR/ALHQ, ALRQ/ALRQ, ALHQ/ALRQ, ALHQ/ALHQ, ALRR/VLRQ, VLRQ/ALHQ, VLRQ /ALRQ и VLRQ /AFRQ. В большинстве своем частота встречаемости гаплотипов и генотипов по четырем кодонам повторяла профили, полученные для кодонов 136/154/171. Только в Pop_4 обнаружили одно животное, несущее в позиции 141 PRNP аллель F, ассоциированный с чувствительностью к атипичной скрепи (генотип VLRQ/AFRQ), что соответствовало частоте встречаемости аллеля 0,001. Важно отметить, что аллель F¹⁴¹ был идентифицирован в сочетании с гаплотипом VRQ, максимально восприимчивым к классической скрепи, в составе генотипа VRQ/ARQ (генетический класс G5).

Как известно, восприимчивость овец к классической скрепи напрямую зависит от определенных несинонимических единичных нуклеотидных полиморфизмов в пределах гена прионового протеина PRNP, локализованного на 13-й хромосоме (34-36). Современные молекулярногенетические технологии позволяют исследовать генотип животного в первые дни жизни и осуществлять ранний контроль над распространением наследственных дефектов. Также выполняются работы по сохранению, использованию и развитию генофондов локальных пород для эффективной интеграции в современное животноводство с целью получения возможных новых селекционных форм и повышения численности животных нативных пород. Цель большинства программ разведения овец — контроль за состоянием генофонда породы посредством постепенного замещения генотипов, характеризующихся повышенной восприимчивостью к скрепи, с использованием баранов с ARR/ARR генотипами. Аккумуляция в породах и отдельных популяциях гаплотипа ARR необходима для обеспечения превентивной защиты от классического патогенного приона, вызывающего скрепи. Этот факт подтверждают исследования, проведенные в Канаде в 2008-2012 годах на 184 овцах романовской породы, показавшие пластичность ее генофонда и позволившие с помощью селекции довести частоту встречаемости гаплотипа ARR и генотипа ARR/ARR соответственно до 0,592 и 0,359 (37). Вместе с тем высокая частота гаплотипа дикого типа в аборигенных и культурных породах, отмеченная в ряде исследований (38, 39), остается актуальной проблемой при селекционной работе.

Таким образом, наши данные позволили оценить аллелофонд овец романовской породы, разводимых на исторических территориях возникновения и в местах интродукции, на генетическую устойчивость к классической и атипичной формами скрепи. Средняя частота встречаемости нежелательного V136R154Q171 гаплотипа и аллеля F141, ассоциированного с чувствительностью к атипичной скрепи, составляла соответственно 0,011 и 0,001, что имеет положительное значение для дальнейшего совершенствования и сохранения романовской овцы. В изученных популяциях выявлен явный дефицит животных с генотипом, относящимся к генетическому классу G1, а частота встречаемости устойчивого к классической скрепи гаплотипа ARR составляла в среднем 0,066. Это создает предпосылки для выполнения стратегических селекционных программ по накоплению устойчивых к патогенному приону генотипов в генофондных стадах романовской породы. Чтобы предотвратить развитие классической и атипичной форм скрепи в российских популяциях, нужно вести селекцию на генетическую резистентность к скрепи, повышая число животных — носителей аллеля ARR и генотипа ARR/ARR. Для эффективной селекционной работы и сохранения популяционно-генетического разнообразия этой уникальной российской северной овцы необходимо исследовать аллело-фонд всего племенного поголовья романовской породы.