Характеристика быков-производителей с разными генотипами альфа S1-казеина по происхождению

В настоящее время в нашей стране практически отсутствуют характеристики генофонда различных пород крупного рогатого скота по генотипам альфа S1 - казеина, в то время как информация о генотипах аллелей молочных белков является у племенных животных существенным фактором, который должен быть учтен при разведении породы, особенно в стратегии выбора быков для стада. Селекционер должен иметь полную информацию о генотипе быка, который используется в стаде. Использование метода ПЦР-анализа позволяет проводить широкомасштабные исследования генетического полиморфизма и отбор животных с желательными аллельными вариантами.

Исследованиями многих ученых установлено для всех пород значительное преобладание варианта В гена альфа S1-казеина, тогда как, по данным Л.С. Жебровского [2], коровы айрширской породы оказались гомозиготными по этому аллелю. Аллель А найден лишь у американских голштинов – 0,086 и коров бурой латвийской, голландской, красной датской, костромской и черно-пестрой пород, разводимых в Беларуси, как отмечается в работах С.А. Петрушко [3]. Наиболее высокая концентрация аллеля С (0,345) отмечена в стаде костромской породы.

Гетотип ВВ альфа S1-казеина у коров влияет на увеличение выхода молока, при этом генотип СС влияет на увеличение содержания белка в молоке. При сравнительном исследование генотипов ВВ и СС локуса альфа-S1 казеина выявлено, что коровы с генотипом ВВ дали молока на 1344 кг (Р<0,05) больше, но в молоке коров с генотипом СС содержание белка было больше на 0,35% [7].

При этом генетические варианты альфа S1 - казеина оказывают влияние на технологические свойства молока. Наличие В -аллеля положительно влияет на скорость свёртывания молока под действием сычужного фермента [1, 4]. Присутствие в генотипе коров С -аллеля улучшает сыродельческие свойства молока [5]. Вариант С альфа S1 - казеина обеспечивает получение более плотного сгустка по сравнению с вариантом В [6]. Сочетание в генотипе В и С аллелей увеличивает выход сыра [9].

Всё выше сказанное говорит о том, что изучению полиморфизма гена α s₁ -казеина у быков-производителей уделяется большое внимание.

Материал и методика исследований. Исследования проводились в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан. Для проведения ДНК-диагностики и оценки по гену α s₁-казеина у 70 быков-производителей были отобраны пробы крови.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом: 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

АС-ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 0,5 ед. Taq ДНК полимеразы, по 0,25 мкМ праймеров CSN1S1-F1: 5/ - TGC ATG TTC TCA TAA TAA CC-3/ и CSN1S1-R1: 5/-GAA GAA GCA GCA AGC TGG - 3/, по 1,0 мкМ праймеров CSN1S1-F2: 5/ - CAT TCC ATT TCC TGT ATA ATG AGG CA-3/ и CSN1S1-R2: 5/ - AAT TCT AAG GAG AGT TTA CAA CAA AGA CGC - 3/, сконструированных Г. Ринкон и Дж. Медрано (G. Rincon and J. F. Medrano, 2003) для амплификации фрагмента гена альфа S1-казеина длиной 310 и 236 bp (аллель В) и 310 и 130 bp (аллель С), 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

×1: 94 0С – 4 мин;

×30: 94 0С – 10 сек, 58 0С – 10 сек, 72 0С – 10 сек;

×1: 72 0С – 7 мин;

хранение: 10 0С.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1×ТВЕ буфере.

После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам.

В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета данного хозяйства, то есть племенные карточки (форма 1-МОЛ), а также каталоги и племенные свидетельства быков-производителей.

Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.

Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену альфа S1-казеина нами были протестированы две пары олигонуклеотидных праймеров: CSN1S1-F1+CSN1S1-R1 и CSN1S1-F2+CSN1S1-R2 по оптимизированной нами технике АС-ПЦР (см. «Материал и методика исследований»).

Праймеры CSN1S1-F1+CSN1S1-R1 и CSN1S1-F2+CSN1S1-R2 инициируют амплификацию фрагментов гена альфа S1-казеина крупного рогатого скота длиной 310 и 236 bp (аллель В ) и 310 и 130 bp (аллель С ), соответственно генотипы ВВ =310/236, ВС =310/236/130 (рис. 1) и СС =310/130.

Рис. 1. Электрофореграмма результата ARMS-PCR для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям B и C гена альфа-S1- казеина

(праймеры SCN1S1-F1+SCN1S1-R1 и SCN1S1-F2+SCN1S1-R2)

Обозначения:

М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим);

1-5) генотип BB (310/236 bp);

6-10) генотип ВC (310/236/130 bp).

После проведения ПЦР-анализа распределение животных по генотипам локуса гена альфа S1-казеина было следующим: 64 (91,4%) быков-производителей имели генотип ВВ , 6 (8,6%) – генотип ВС , при этом животных с генотипом СС не обнаружено. Частота аллеля В достигла 0,96, аллеля С – 0,04 (табл. 1).

1. Полиморф			изм гена альфа S1-казеина у быков-производителей
Хозяйство		n	Генотипы						Частота аллелей		χ2
			ВВ		ВС		СС
			n	%	n	%	n	%	В	С
ГУП ГПП «Элита»	Н	70	64	91,4	6	8,6	0	0	0,96	0,04	0,22
	О		65	92,9	5	7,1	0	0

Н – наблюдаемое распределение генотипов, О – ожидаемое распределение генотипов

Для оценки быков-производителей по происхождению использованы индексы племенной оценки быков, в которые входили показатели ближайших женских предков. Родительский индекс показывает степень возможной передачи потомству молочной продуктивности, то есть давления генотипа производителя на молочную продуктивность потомства. Характеристика быков-производителей с разными генотипами альфа S1-казеина по происхождению представлена в таблице 2.

2. Характеристика быков-производителей с разными генотипами альфа S1 - казеина по молочной продуктивности женских предков
Показатели		Генотип быков по локусу альфа S1 - казеина		Разница ВС-ВВ
		ВВ	ВС
Число быков		64	6	-
Матери	удой, кг	8574±219,7	10281±360,1	+1707***
	жир, %	3,88±0,03	3,88±0,06	0
ММ	удой, кг	7074±265,4	9708±517,6	+2634***
	жир, %	3,87±0,04	3,92±0,14	0,05
МО	удой, кг	10538±381,7	11704±734,1	+1166
	жир, %	4,01±0,04	4,53±0,28	+0,52
Родословный индекс	удой, кг	8690±217,3	10494±192,2	+1804***
быка (РИБ)	жир, %	3,91±0,02	4,05±0,10	+0,14
*** - Р<0,001

Анализ таблицы показывает, что наибольшие показатели по удою имели матери быков с генотипом ВВ альфа S1 - казеина (10281 кг), что выше, чем у матерей быков с генотипом ВС на 1707 кг (Р<0,001). При этом матери быков с генотипом ВВ и ВС по содержанию жира в молоке не отличались.

Более высокие показатели по удою и содержанию жира в молоке имели матери матерей (ММ) и матери отцов (МО) быков с генотипом ВС альфа S1 - казеина (9708кг и 11704 кг; 3,92% и 4,53%), что выше, чем у аналогов с генотипом ВВ соответственно на 2634 кг (Р<0,001) и 1166 кг; 0,05% и 0,52%.

Оценка быков по родительскому индексу позволила выявить, что используемые быки не равноценны по происхождению. Так, родительский индекс (РИБ) быков с генотипом ВС альфа S1-казеина обладал более высокой молочностью – 10494 кг и жирностью молока – 4,05%, что несколько выше, чем у быков с генотипом ВВ соответственно на 1804 кг (Р<0,001) и 0,14%.

Вывод. По результатам оценки быков-производителей по происхождению более высокие показатели были у быков с генотипом ВС альфа S1 - казеина, чьи женские предки имели более высокую молочную продуктивность.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Афанасьев, М.П. Химический состав и технологические свойства молока коров различных пород. / М.П. Афанасьев, И.П. Ардатовская // Тезисы докл. Респ. научн. производ. конф. – Казань, 1996. – С. 202. 2. Жебровский, Л.С. Генетические, селекционные, биохимические и физиологические основы изучения белков молока и крови крупного рогатого скота: Библиограф, указ./ Л.С. Жебровский [и др.]. – Л.: ЛГУ. – 1975. – 203 с. 3. Петрушко, С.А. Изучение генетического полиморфизма белков молока крупного рогатого скота : автореф. дисс. канд. с.-х. наук : 06.02.01 / С.А. Петрушко. – Беларусь. – Минск, 1970. – 19 с. 4. Хаертдинов, Р.А. Селекция на повышение белковости и улучшение технологических свойств молока / Р.А. Хаертдинов, А.М. Гатауллин. – Казань, 2000. – 132 с. 5. Jakob, E. Genetic polymorphism of milk proteins / E. Jakob // Mlejelarstvo. – 1994. – N. 44. – P. 197-217. 6. Mariani, P. Rennet coagulation properties of cow milk in relation to α s1-casein genotypes / P. Mariani, P. Bonatti, M. Pecorari // Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia.-1988. – № 39. – Р. 431-438. 7. Pečiulaitienė, N. Genetic factors influencing milk production traits in Lithuanian dairy cattle breeds / N. Pečiulaitienė [et al.]. – 2007. – V. 14. – № 1. – P. 32-38. 8. Rincon, G. Single nucleotide polymorphism genotyping of bovine milk protein genes using the tetra-primer ARMS-PCR / G. Rincon, J. F. Medrano // J. Anim. Breed. Genet. – 2003. –V. 120 – P. 331-337. 9. Samarzija D. Polymorphism of milk protein in cheese production / D. Samarzija [et al.] // Mluekarstvo. – 1992. – V. 41. – P. 319-327.

ХАРАКТЕРИСТИКА БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ АЛЬФА S1-КАЗЕИНА ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ

Тюлькин С.В., Ахметов Т.М., Муратова А.В., Вафин Р.Р.

Резюме

Представлена предварительная оценка племенной ценности быков-производителей с разными генотипами альфа S1-казеина. Изучены признаки молочной продуктивности (удой и содержание жира в молоке) ближайших женских предков быков-производителей с генотипами ВВ и ВС альфа S1-казеина. Исследования показали, что более высокую оценку по происхождению имели быки-производители с генотипом ВС альфа S1-казеина.

THE CHARACTERISTICS OF BULL-PRODUCERS WITH DIFFERENT GENOTYPES OF ALPHA S1-CASEIN BY ORIGIN

Tjulkin S.V., Ahmetov T.M., Muratova A.V., Vafin R.R.