Характеристика быков-производителей с разными генотипами бета-казеина по происхождению

В настоящее время в нашей стране практически отсутствуют характеристики генофонда различных пород крупного рогатого скота по генотипам, в то время как информация о генотипах аллелей молочных белков является у племенных животных существенным фактором, который должен быть учтен при разведении породы, особенно в стратегии выбора быков для стада. Селекционер должен иметь полную информацию о генотипе быка, который используется в стаде. Использование метода ДНК-анализа позволяет проводить широкомасштабные исследования генетического полиморфизма и отбор животных с желательными аллельными вариантами.

Фракция бета-казеина вторая по величине фракция казеина в молоке, по массе белка она уступает лишь α s 1 -казеину. В полипептидной цепи молекулы β -казеина насчитывается 209 аминокислотных остатков, из которых пять принадлежат фосфосерину (F. Grosclaude, 1979).

Встречаются несколько молекулярных форм бета-казеина ( А 1 , А 2 , А 3 , В, С, D, Е ), которые различаются по аминокислотному составу и электрофоретической подвижности (B. Seibert et al., 1985; M Baranyi et al., 1993). В настоящее время известно 11 вариантов β -казеина (А.М. Машуров, 1980).

А.С. Митюков (1974) в своих исследованиях установил, что содержание бета-казеина ВВ в молоке коров всех пород положительно коррелируется с содержанием жира в молоке, а бета-казеина АА – отрицательно.

Установлено, что В-аллель бета-казеина благоприятно влияет на сыродельческие свойства молока (Н.Н. Мухаметгалиев, 2006). М.П. Афанасьев (1996) считает, что В-аллель β-казеина обладает самостоятельным положительным влиянием на сыродельческие свойства молока и усиливает аналогичное действие В-аллеля каппа-казеина.

Молоко, содержащее бета-казеин типа ВВ , более термоустойчиво по сравнению с молоком, где имеется АА тип (D.M. Mc Lean et al., 1987). Однако в исследованиях Н.Н. Мухаметгалиева (2006) получены противоположные результаты. Так, отрицательное влияние В аллеля по локусу β -казеина на термоустойчивость молока особенно четко проявлялось в группах чистопородных голштинских и айрширскийх коров. Коагуляция белков в молоке коров с генотипом АВ , в сравнении с показателем животных, имеющих в локусе β -казеина А аллелли, происходила раньше на 28,4 и 14,7 мин., соответственно.

Всё выше сказанное говорит о важности оценки быков-производителей с разными генотипами бета-казеина по происхождению.

Материал и методика исследований. Исследования проводились в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан. Для проведения ДНК-диагностики и оценки по гену бета-казеина у 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей были отобраны пробы крови.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом: 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl 2 , 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймеров O-bcas-F: 5^/-AACATCCCTCC-TCTTACTCAAACCCCTG-3^/ и O-bcas-R: 5^/-

ATATCTCTCTGGGGATAGGGC-ACTGCTT-3/    и    I-bcas-F:    5/-

AATATCCAGTTGAGCCCTTTACTGAATGC-3/   и   I-bcas-R:    5/-

CAACATCAGTGAGAGTCAGGCTCAGC-3/,   сконструированных Г.

Ринкон и Дж. Медрано (G. Rincon, J.F. Medrano, 2003) для амплификации фрагмента гена бета-казеина длиной 338 и 217 bp (аллель А ) и 338 и 177 bp (аллель В ), 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

×1:94 0С – 4 мин; ×40:94 0С – 10 сек, 63 0С – 10 сек, 72 0С – 10 сек;

×1:72 0С – 7 мин; хранение: 10 0С.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1×ТВЕ буфере.

После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам.

В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета данного хозяйства, то есть племенные карточки (форма 1-МОЛ), а также каталоги и племенные свидетельства быков-производителей.

Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:

р = n / N, где р - частота определения генотипа, n - количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формулам:

РА = (2nAA+nAB) : 2N и qB = (2nBB+nAB) : 2N, где РА - частота аллеля А, qB - частота аллеля В, N - общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга (В.Л. Петухов, А.И. Жигачёв, Г.А. Назарова, 1985) рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Вычислен родительский индекс по Н.А. Кравченко (1963) для каждого быка по удою и жирномолочности их женских предков.

РИБ = (2М + ММ + МО) / 4, где М – матери, ММ – матери матерей, МО – матери отцов.

Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.

Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета-казеина нами был протестирован набор олигонуклеотидных праймеров: O-bcas-F+O-bcas-R и I-bcas-R+I-bcas-F по оптимизированной нами технике ARMS-PCR (см. «Материал и методика исследований»).

Праймеры O-bcas-F+O-bcas-R и I-bcas-R+I-bcas-F инициируют амплификацию А -аллель-специфичного и В -аллель-специфичного фрагментов ДНК гена бета-казеина крупного рогатого скота размером 338, 217 bp (аллель А ) и 338, 177 bp (аллель В ) соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма результата аллель-специфичной ПЦР для генотирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена бета-казеина с праймерами O-bcas-F+O-bcas-R и I-bcas-R+I-bcas-F

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим); 1, 2, 5) генотип АА (338/217 bp); 3, 4) генотип АВ (338/217/177 bp).

После проведения ПЦР-анализа распределение животных по генотипам локуса гена бета-казеина было следующим: 61 (87,1%) быков-производителей имели генотип АА , 9 (12,9%) – генотип АВ , при этом животных с генотип ВВ не обнаружено. Частота аллеля А достигла 0,94, аллеля В – 0,06 (табл. 1).

1. Полиморфизм гена бета-казеина у быков-производителей

Хозяйство		n	Генотипы						Частота аллелей		χ2
			АА		АВ		ВВ
			n	%	n	%	n	%	А	В
ГУП ГПП «Элита»	Н	70	61	87,1	9	12,9	0	0	0,94	0,06	0,14
	О		62	88,6	8	11,4	0	0

Н – наблюдаемое распределение генотипов, О – ожидаемое распределение генотипов

Для оценки быков-производителей по происхождению использованы индексы племенной оценки быков, в которые входили показатели ближайших женских предков. Родительский индекс показывает степень возможной передачи потомству молочной продуктивности, то есть давления генотипа производителя на молочную продуктивность потомства. Характеристика быков-производителей по происхождению представлена в таблице 2.

Анализ таблицы показывает, что наибольшие показатели по удою и содержанию жира в молоке имели матери быков с генотипом АА бета-казеина (8752 кг и 3,89%), которые были выше, чем у матерей быков с генотипом АВ на 389 кг и 0,09% соответственно.

Более высокий удой был характерен для матерей матерей (ММ) быков с генотипом АВ (8104 кг), тогда как по содержанию жира в молоке выделялись матери матерей быков с генотипом АА (3,89%). При этом разница между матерями матерей с генотипом бета-казеина АА и АВ по содержанию жира составила 0,15% (Р<0,05).

2. Характеристика быков-производителей с разными генотипами бета-казеина по молочной продуктивности женских предков

Показатели		Генотип быков по локусу бета-казеина		Разница АА-АВ
		АА	АВ
Число быков		61	9	-
Матери	удой, кг	8752±225,5	8363±654,2	+389
	жир, %	3,89±0,03	3,80±0,04	+0,09
ММ	удой, кг	7201±262,5	8104±1226,4	-903
	жир, %	3,89±0,05	3,74±0,04	+0,15*
МО	удой, кг	10678±394,9	10230±227,8	+448
	жир, %	4,04±0,05	4,13±0,18	-0,09
Родословный индекс быка (РИБ)	удой, кг	8846±225,8	8765±570,6	+81
	жир, %	3,92±0,03	3,87±0,05	+0,05

* - Р<0,05

Более высокий удой характерен для матерей отцов (МО) быков с генотипом АА (10678 кг), а более высоким содержанием жира в молоке отличались аналоги с генотипом АВ (4,13%). При этом разница по этим показателям составила 448 кг и 0,09%.

Оценка быков по родительскому индексу позволила выявить, что используемые быки не равноценны по происхождению. Так, родительский индекс (РИБ) быков с генотипом АА бета-казеина обладал более высокой молочностью – 8846 кг и жирностью молока – 3,92%, что незначительно выше, чем у быков с генотипом АВ (на 81 кг и 0,05%).

Вывод. По результатам оценки быков-производителей по происхождению более высокие показатели были у быков с генотипом АА бета-казеина, чьи женские предки имели более высокую молочную продуктивность.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Афанасьев, М.П. Генетическая структура, белковый состав и технологические свойства молока холмогорской, венгерской, голштинофризской пород скота и их помесей: автореф. дис. канд. биол. наук: 06.02.01. / Афанасьев Михаил Павлович. – Казань, 1996. – 24 с. 2. Машуров, А. М. Генетические маркеры в селекции животных / А.М. Машуров. – М.: Наука. – 1980. – 315 с. 3. Митюков, А.С. Генетическая обусловленность внутрипородных качественных вариаций полиморфных систем белков молока: автореф дисс. канд. биол. наук: 06.02.01 / Митюков Александр Сергеевич. – Л. – Пушкин, 1974. – 15 с. 4. Мухаметгалиев, Н.Н. Использование генетической и паратипической изменчивости белкового состава молока для улучшения технологических свойств сырья и повышения качества молочных продуктов: автореф. дисс. докт. биол. наук: 06.02.01 / Нурвахит Нургалиевич Мухаметгалиев. – 2006. – 34 с. 5. Baranyi, M. Genetic Polymorphism of Milk Protein in Hungarian Spotted and Hungarian Grey Cattle: A Possible New Genetic Variants of β -lactoglobulin / M. Baranyi [et al.] // J. Dairy Sci. – 1993. – № 76. – Р. 630-636. 6. Grosclaude, F. Polymorphism of milk proteins: some biochemical and genetical aspects / F. Grosclaud // Proc. of the 18 th International Conference on animal blood groups (Leningrad). – 1979. – V. 1. – P. 54-62. 7. Mc Lean, D.M. Effect of milk protein genetic variants and composition on heat stability of milk / D.M. Mc Lean [et al.] // J. Dairy Res. – 1987. – № 54. – Р. 219-235. 8. Rincon, G. Single nucleotide polymorphism genotyping of bovine milk protein genes using the tetra-primer ARMS-PCR / G. Rincon, J.F. Medrano // J. Anim. Breed. Genet. – 2003. – V. 120 – P. 331-337. 9. Seibert, B. Procedure for simultaneous phenotyping of genetic variants in cow ′ s milk by isoelectric focusing / B. Seibert, G. Erhardt. B. Senft // Animal Blood Groups and Biochemical Genetics. – 1985. – № 16. – Р. 183-191.

ХАРАКТЕРИСТИКА БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ БЕТА-КАЗЕИНА ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ

Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Вафин Р.Р., Кабиров И.Ф. Резюме

Представлена предварительная оценка племенной ценности быков-производителей с разными генотипами бета-казеина. Изучены признаки молочной продуктивности (удой, содержание и количество молочного жира) ближайших женских предков быков-производителей с генотипами АА и АВ бета-казеина. Исследования показали, что более высокую оценку по происхождению имели быки-производители с генотипом АА бета-казеина.

THE CHARACTERISTICS OF BULL-PRODUCERS WITH DIFFERENT GENOTYPES OF BETA-CASEIN BY ORIGIN

Ahmetov T.M., Tjulkin S.V., Vafin R.R., Kabirov I.F.