Характеристика межклеточных взаимоотношений при ВИЧ/ТБ ко-инфекции с учетом экспрессии биомаркеров CD3+, CD7+, CD10+ в легких

Введение. Рост ВИЧ - ассоциированного туберкулёза (ВИЧ/ТБ) регистрируется во многих странах, в т.ч. в РФ. Среди причин смерти у ВИЧ-инфицированных туберкулёз, по различным данным, составляет 43-89%, что выводит его на лидирующую позицию [1]. Полиморфизм клинических проявлений туберкулёза на стадии СПИДА, затрудняет его посмертную морфологическую верификацию, что требует дальнейшего изучения патогенеза двойного заболевания ВИЧ/ТБ [2]. Иммунный ответ макроорганизма на внедрение в него микобактерий туберкулеза включает клеточное и гуморальное звенья с взаимодействием Т-лимфоцитов, макрофагов, иммуноглобулинов. Иммуноглобулины G участвуют в образовании иммунных комплексов, в активации системы комплемента, оседают на микробных клетках, чем усиливают фагоцитоз [3]. Повреждение CD4⁺ вследствие тропности ВИЧ к лимфоцитам с последующим цитопатическим эффектом со снижением иммунокомпетентных клеток предрасполагает к изменению клеточных и тканевых реакций [4]. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению патоморфогенеза, иммуноморфологии ко-инфекции ВИЧ/ТБ клеточные изменения в очагах гранулематозного воспаления остаются малоизученными, большинство данных носит противоречивый характер, а функциональная активность оценивалась иммуноферментны-ми методами в сыворотке крови[3].

Изучение экспрессии CD3+,CD7+,CD10+ в тканях легких при ВИЧ/ТБ ко-инфекции представляет особый интерес, т.к. может охарактеризовать взаимоотношения между клеточными и гуморальными звеньями иммунитета непосредственно в очагах воспалительного ответа.

Цель исследования - оценить степень экспрессии CD3⁺,CD7⁺,CD10⁺ в очагах гранулематозного воспаления в тканях лёгких больных, умерших от туберкулёза на фоне ВИЧ-инфекции.

Материал и методы исследования. Исследован аутопсийный материал (n=30) умерших пациентов с ТБ легких, на стадии ВИЧ 4Б-5 - группа 1. В группу сравнения - группа 2 - вошли аутоп-сийные случаи (n=30) с моно-инфекцией, c остро прогрессирующими формами ТБ легких. Образцы легких извлекались из трупов по общепринятым методикам в ранние сроки после смерти больного, фиксировались в 10 % растворе забуференного формалина в течение суток при комнатной температуре, промывались и подвергались стандартной гистологической проводке. Из парафиновых блоков были изготовлены гистологические препараты, окрашенные гематоксилином и эозином.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с целью определения экспрессии биомаркеров CD3+,CD7+,CD10+ проводили с использованием крольчих моноклональных антител фирмы Epitomics - an Abcam. Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной демаскировкой антигенов, исследование микропрепаратов проводили на микроскопе «Micros» (Austria), производили микрофотосъемку цифровой фотокамерой «Olympus» (Japan), выраженность экспрессии биомаркеров оценивали, с применением программы Image Analysis с последующим морфометрическим анализом. Статистическую обработку материалов осуществляли с помощью прикладной программы Statistica 6.0, разработанной для медико-биологических исследований, за величину уровня статистической значимости принимали р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В 1 группе исследования (ВИЧ/ТБ ко-инфекция), при окраске гематоксилином и эозином, в микропрепаратах легких наблюдался полиморфизм изменений. В паренхиме лёгких отмечались участки эмфиземы, сменяющиеся ателектазами, как правило, наблюдалось утолщение межальвеолярных перегородок. В альвеолах обнаруживались слущенные эпителиальные клетки, макрофаги, большая часть которых была со светлой цитоплазмой, лимфоциты, количество которых варьировало, различное количество серозного, геморрагического и смешанного экссудата. Кроме того, в просветах альвеол наблюдались казеозные массы, а также тканевый детрит. Выявлялись зоны формирующегося продуктивного воспаления, представленные очагами лимфогистиоцитарной инфильтрации, локализованными чаще в периваскулярных отделах и участки формирующихся пневмониогенных каверн с различными по выраженности инфильтративными явлениями от умеренных до выраженных, а также фокусы гранулематозного воспаления, в которых выявлялись выраженные по площади зоны казеозного некроза, эпителиоидные клетки, незначительное количество лимфоцитов, практически отсутствовали гигантские клетки Пирогова – Лангханса.

Во 2-ой группе (моно-инфекции ТБ), изменения характеризовались наличием в легких эпителиоидно-клеточных гранулем туберкулоид-ного типа с гигантскими многоядерными клетками Пирогова-Лангханса, значительным количеством малых лимфоцитов и различных по величине фокусов казеозного некроза. Отмечались очаги слабовыраженного фиброза и продуктивного воспаления в субплевральных отделах с гистио-цитарной инфильтрацией.

При ИГХ исследовании легких с использова- нием моноклональных антител к CD3+ в 1 группе (ВИЧ/ТБ) исследования вне зон воспалительного инфильтрата отмечалась слабая и умеренная (1-2 балла) цитоплазматическая экспрессия иммунореактивного материала (ИРМ) в лимфоцитах. В зонах специфического воспаления отмечена также слабовыраженная (1 балл) экспрессия ИРМ в лимфоцитах. При использовании моноклональных антител к CD7+ в 1 группе исследования (ВИЧ/ТБ) вне зон воспалительного инфильтрата отмечалась умеренная и выраженная (2-3 балла) цитоплазматическая экспрессия иммунореативного материала, а в фокусах специфического воспаления отмечалась выраженная и резко выраженная экспрессия ИРМ (3-4 балла) как в лимфоцитах так и в некротических массах. При ИГХ реакции с биомаркером к CD10+ вне зон воспаления наблюдалась слабовыраженная ИРМ (1 балл), а в воспалительном инфильтрате она практически отсутствовала (0-1 балл).

При ИГХ исследовании легких во 2 группе (моно-инфекция ТБ) с использованием моноклональных антител к CD3+ в большинстве случаев вне зон воспаления была обнаружена резко выраженная степень (4 балла) цитоплазматической экспрессии ИРМ в лимфоцитах, а в зонах гранулематозного воспаления реакция носила резко выраженный характер и в казеозном детрите. При ИГХ исследовании с использованием моноклональных антител к CD7+ отмечалась слабая и умеренная (1-2 балла) экспрессия ИРМ как вне зон специфического воспаления, так и в казеозно-пневмонических очагах. При изучении ИГХ с использованием моноклональных антител к CD10+ вне зон воспаления отмечалась слабая экспрессия ИРМ, а в зонах воспаления наблюдалась экспрессия ИРМ от умеренной до выраженной, которая сохранялась в центрах некрозов.

Для объективизации оценки иммуноморфо-логических изменений в различных областях легких проведен программный морфометрический анализ. При ИГХ исследовании легких с использованием моноклональных антител к CD3+ отмечены различия в значениях морфометрических параметров: вне зон воспаления в 1 группе относительная площадь иммунопозитивных объектов (ИПО) была в 23 раза меньше (р<0,001) по сравнению с группой сравнения (группа 2), а в фокусе воспаления этот параметр был меньше в 17 раз (р<0,001) по сравнению с моно-инфекцией ТБ.

При ИГХ исследовании легких с использованием моноклональных антител к CD7+ выявлено изменение морфометрических параметров: увеличение относительной площади ИПО в зонах воспаления в 20,7 раз (р<0,001) в группе 1 при ВИЧ/ТБ ко-инфекции, вне зон воспаления относительная площадь ИПО увеличилась на 2,6% (достоверных различий не выявленно) по сравнению с группой 2.

При ИГХ исследовании легких с использованием моноклональных антител к CD10+ выявлено изменение морфометрических параметров: уменьшение относительной площади ИПО в зонах воспаления в 12,5 раз (р<0,001) в группе 1 при ВИЧ/ТБ ко-инфекции, вне зон воспаления относительная площадь ИПО увеличилась на 2,8% (достоверных различий не выявленно) по сравнению с группой 2 - иммуноморфологического.

Таким образом, нами выявлено уменьшение уровня экспрессии биомаркера CD3+ в малых лимфоцитах в различных зонах легких при ВИЧ/ТБ коинфекции с минимальной экспрессией в фокусах воспаления, а также снижение в фокусах гранулематозного воспаления количества лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+ по сравнению с группой моно-инфекции ТБ. Отмечено возрастание уровня экспрессии биомаркера CD7+ как в казеозно-некротических очагах, так и вне зон воспаления при ВИЧ/ТБ ко-инфекции по сравнению с группой моно-инфекции ТБ. Уменьшение экспрессии белка CD3+ при ВИЧ/ТБ ко-инфекции свидетельствует о снижении количества зрелых Т-лимфоцитов с антиген распознающим рецептором в зонах воспалительного инфильтрата. Увеличение содержания лимфоцитов с иммунофенотипом CD7+, которые являются клетками предшественниками Т- лимфоцитов и выполняют регуляторную роль в активации Т-хелперов и Т- супрессоров, возможно, свидетельствует об дисрегуляции вторичного иммунного ответа, обусловливающего супрессию противотуберкулезного иммунитета, а также об изменении регуляции механизмов клеточной гибели при сочетанной инфекции, что приводит к большей инициации апоптоза особенно в фокусах продуктивного воспаления.

Отмеченное снижение уровня экспрессии CD10+ в зонах воспаления при ВИЧ/ТБ ко-инфекции по сравнению с моно-инфекцией ТБ свидетельствует о нарушениях гуморального звена иммунитета при сочетанной патологии, так как экспрессия рецептора CD10+ на поверхности незрелых В-лимфоцитов является этапом их дифференцировки, которые в результате бластной трансформации превращаются в плазматические клетки, синтезирующие различные типы иммуноглобулинов и поддерживающие Т-хелперную, макрофагальную активность в инициации и согласовании адаптивного иммунного ответа [5].

Заключение. Таким образом, выявленное в нашем иммуноморфологическом исследовании снижение количества CD3+лимфоцитов и возрастанием числа CD7+ лимфоцитов в паренхиме легких и в фокусах продуктивного воспаления при ко-инфекции ВИЧ/ТБ свидетельствует о глубоком угнетении иммунного ответа при ВИЧ-инфекции на терминальных стадиях приобретенного иммунодефицита, с развитием туберкулеза, и характеризуется снижением количества морфологически зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) на фоне возрастания числа незрелых CD7+ лимфоцитов, преимущественно, в очагах продуктивного воспаления. Кроме того, обнаруженное при ко-инфекции ВИЧ/ ТБ уменьшение количества CD10+ лимфоцитов в фокусах продуктивного воспаления в легких свидетельствует о нарушении процессов дифференцировки В-лимфоцитов, что способствует глубокому угнетению гуморального звена иммунитета и гипоэргическому ответу на микобактерии туберкулёза.