Характеристика патогенного потенциала E. coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы

Acknowledgments : the work has been carried out within the framework of the state assignment of the Ministry of Agriculture of Russia for applied scientific research (state registration number NIR AAAA-A19-119101890005-1).

Введение. Патологии почек и мочевыводящих путей играют одну из ведущих ролей в нозологии незаразных заболеваний мелких домашних животных и представляют важную проблему для ветеринарной медицины. В видовом спектре микроорганизмов, выделенных из мочи кошек при циститах и мочекаменной болезни, наряду с бактериями рода Staphylococcus выявлено доминирование E. coli [1]. Известно, что кишечная палочка может способствовать развитию инфекционно-воспалительных осложнений, а также рецидиву заболевания, это обусловлено спектром биологических свойств микроорганизмов, инициирующих воспалительный процесс [2]. Однако информации, касающейся биопрофиля E.coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыводящей системы, не достаточно.

Цель исследования – фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов E. coli , изолированных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы.

Условия, материалы и методы. В работе были изучены 12 штаммов E. coli, выделенных из мочи 54 кошек с патологией мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь и цистит) и находящихся на лечении в ветеринарных клиниках г. Оренбурга. Пробы мочи получали от больных животных методом катетеризации и доставляли на исследование в течение 1–2 ч. Выделение бактерий проводили стандартными методами. Видовую идентификацию осуществляли с помощью масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT (BrukerDaltonics, Германия) и программного обеспечения MaldiBioTyper 3,0. Антилизоцимную активность (АЛА), био- пленкообразование (БПО), гемолитическую активность (ГА) и показатель адгезии микробных клеток (ПА) определяли стандартными фотометрическими методами. Резистентность к фторхинолонам (энрофлоксацину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину) определяли диско-диффузионным методом [3]. Бактериальную дезоксирибонуклеиновую кислоту экстрагировали с помощью реактивов «ДНК-экспресс» («Литех», Россия). Циклический синтез фрагментов ДНК осуществляли с использованием амплификатора «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Для определения наличия генов вирулентности и резистентности использовали специфические олиго-нуклеотидные праймеры, описанные в научных публикациях [4–6] и синтезированные фирмой «Синтол» (Россия) (табл.).

Праймеры, использованные при мультиплексной ПЦР, и размеры ампликонов

Окончание табл.

Статистический анализ результатов осуществлен с применением программ MS Excel 2007.

Результаты и обсуждение. При бактериологическом исследовании мочи E. coli были выделены в 22,2 % случаев, в 33,3 % микроорганизмы были в виде монокультуры, в 66,7 % – в ассоциациях с другими микроорганизмами ( S. aureus, S. intermedius, E. faecalis, K. pneumonia ). У выделенных E. coli определен комплекс биологических свойств (биопрофиль), включающий их вирулентные и персистентные характеристики, а также антибиотикорезистентность. Частота обнаружения ГА, БПО и АЛА составляла 100 %, способностью к адгезии характеризовались 66,7 % E. coli . Среднее значение ГА у исследованных штаммов E. coli было равно 6,8 ± 0,85 %, выраженность АЛА составила 1,1 ± 0,05 мкг/мл, а способность образовывать биопленки – 1,43 ± 0,42 у. е.

Далее была определена чувствительность E. coli к фторхинолонам, которые являются оптимальными препаратами для эмпирической терапии неосложненных инфекций как верхних, так и нижних мочевых путей. Выявлено, что по отношению к ципрофлоксацину половина изу- ченных штаммов проявляла чувствительность, а вторая половина – умеренную резистентность; к энрофлоксацину чувствительных штаммов не было, при этом 16,7 % культур характеризовались резистентностью и 83,3 % – умеренной резистентностью. К норфлоксацину все исследованные E. coli проявляли чувствительность, к офлоксацину и левофлоксацину по 16,7 % культур были умеренно резистентными, остальные чувствительными.

Сравнительный анализ распространенности изученных свойств у E. coli , выделенных в монокультуре и ассоциациях, выявил их отличие по способности к биопленкообразованию (50 % штаммов, выделенных в ассоциациях и 100 % изолятов в монокультуре) и адгезии (75 и 50 % соответственно). Установлено, что ГА изолятов E. coli в ассоциациях составила 7,7 ± 0,09 %, тогда как у монокультур – 5,1 ± 0,36 % (p < 0,01), и, напротив, значения БПО и ПА были выше у монокультур (1,7 ± 0,07 и 1,1 ± 0,13 у. е., р < 0,05; 17,0 ± 0,03 и 11,9 ± 0,89 %, р < 0,05). По уровню АЛА выделенные штаммы не отличались (рис.).

■ БП ПА □ ГА н АЛА

Биопрофили E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях при цистите и МКБ: БП – биопленкообразование, у. е.; АЛА – антилизоцимная активность, мкг/(мл·ОП); ГА – гемолитическая активность, %; ПА – показатель адгезии, %; (*) – р ≤ 0,05; (**) – р ≤ 0,01

Затем был охарактеризован вирулентный потенциал штаммов E. coli на уровне генотипа. Установлено, что у всех выделенных культур регистрировались следующие гены, ответственные за адгезию: fim H и pap A и отсутствовали гены afa B и afa C . Это связано с тем, что у грамотрицательных микроорганизмов функцию распознавания и прикрепления осуществляют пили, или фимбрии, а у грамположительных бактерий в адгезии участвуют афимбриальные структуры. Встречаемость данного фактора среди уропатогенных штаммов достаточно сильно варьирует, так, в исследованиях [7] у 45 изолятов эшерихий, выделенных от собак и кошек с инфекциями мочевыводящих путей, не обнаружен ген afa , что согласуется с полученными нами данными. Установлено наличие у всех изолированных нами E. coli гена kps M , детерминирующего синтез капсульного полисахарида, защищающего от иммунной системы хозяина, а также гена hly A , относящегося к порообразующим токсинам, лизирующим эритроциты и ядросодержащие клетки. Ген usp , кодирующий уропатогенный специфичный протеин, выявлен нами у 83,3 % E. coli . Известно, что выработка сидерофоров, определяющих способность бактериальных клеток к захвату железа, повышает жизнеспособность микроорганизмов внутри уретрального тракта и активируется во время инфекции. Показано, что экспрессия сидерофоров повышена в уропатогенах по сравнению с комменсальными штаммами E. coli [8], что демонстрируют проведенные нами исследования, установившие присутствие гена fyu A у всех выделенных изолятов. У всех изученных штаммов также выявлены гены gyr A и par С , ответственные за формирование устойчивости к фторхинолонам, гены qnr B и qnr S , кодирующие белки, уменьшающие связывание хинолона с ДНК и последующее образование комплекса хинолон-гираза; при этом только 66,7 % культур характеризовались наличием гена qrn A .

Проведенный анализ биопрофиля E. coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, показал, что данные микроорганизмы, как в монокультуре, так и ассоциациях, характеризуются выраженным патогенным потенциалом, который определяется наличием у них комплекса вирулентных и пер- систентных свойств, включая ГА, АЛА, БПО, адгезию, антибиотикорезистентность. Таким образом, вирулентный биопрофиль E. coli можно применять как критерий скрининга у больных животных возможных возбудителей заболеваний для последующей селективной элиминации. С другой стороны, настораживает факт значительного распространения генов резистентности к антибиотикам из группы фторхинолонов, которые являются препаратами выбора. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фторхинолоны должны использоваться для терапии заболеваний мочевыделительной системы только после определения чувствительности E. coli к антибиотикам данной группы.

Заключение

• 1.    Штаммы, выделенные из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, характеризуются определенным биопрофилем и выраженным патогенным потенциалом.

• 2.    Молекулярно-генетическим методом у уроизолятов с высокой частотой определено наличие генов, кодирующих адгезины, факторы колонизации и персистенции, а также резистентность к фторхинолонам.