Характеристика таутомерных форм оротата калия, полученных методом механоактивации

Фармацевтический эффект многих лекарственных препаратов зависит от изомерного состояния действующих веществ этих препаратов, причем биологическая активность изомеров, как правило, сильно различается [8, 10]. Влияние таутомерии на способность органических соединений взаимодействовать с биологическими системами (например, молекулой ДНК) обсуждается в ряде работ [9].

Таутомерные превращения происходят, как правило, в растворе, газовой фазе или аморфном состоянии, поскольку перенос протонов в таких состояниях происходит легко. Получение изомеров (таутомеров) лекарственных препаратов с измененными физико-химическими свойствами возможно при их механообработке [1]. Механохи- мически-индуцированные структурные превращения показаны для солей калия, натрия, кальция, магния [3, 5, 6].

Оротат калия относятся к хорошо известным препаратам для лечения и профилактики заболеваний печени, сердечно-сосудистой системы. Механизм действия оротовой кислоты обусловлен ее действием на нуклеотидный обмен [2, 7], однако эффективность действия препаратов на основе оротатов ограничена их низкой растворимостью и, как следствие, биологической доступностью.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Получить таутомерные формы оротатов калия методом механоактивации, оценить физико-химических характеристики таутомеров и сопоставление эффективности их действия на организм лабораторных животных.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Механоактивация оротата калия (Калия оро-тат, ОАО АВВА РУС, Россия) проводилась в шаровой планетарной мельнице АГО-2С с водяным охлаждением барабанов. Длительность обработки исходного препарата составила 1, 3 и 6 ч. Скорость вращения барабанов составляла 600 об./мин. Температура механоактивиро-ванной смеси составляла порядка 60 °C. Морфология частиц порошка оротата калия после механоактивации исследовалась методом атомной силовой микроскопии с использованием сканирующей лаборатории Интегра-Прима в полукон-тактном режиме на воздухе. Рентгенофазовый анализ проводился на спектрометре Bruker D8 Advance с использованием CuKα-излучения. ИК-спектры получали на ИК Фурье спектрометре ФСМ 1202. NEXAFS-спектры получены на оборудовании Центра Гельмгольца (Берлин, Германия) синхротронного центра BESSY II.

Биологические исследования проводились на белых беспородных крысах (Rattus Norvegicus Berk) № 30, массой 180–200 г с индуцированной гепатопатией (ИГ) [4]. Для этого животные с ИГ были разделены на 3 группы по 10 крыс в каждой, которые ежедневно перорально получали оротат калия (ОрКа) в суточной дозе 5г/животное, что соответствует терапевтической дозировке лекарственного препарата. Экспериментальная группа 1 получала лекарство в исходной оксо-форме, без механообработки (ОрКа-1), группа 2 – (ОрКа-2) с длительностью механообработки в течение 1-го часа (гидрокси-форма), группа 3 – в (ОрКа-3) с длительностью механообработки в течение 6 часов (дигидрокси-форма). Препарат с длительностью обработки в течение 3 часов в биологическом эксперименте не использовался, поскольку

Рис. 1. Форма частиц порошка калия оротата после механоактивации в течение 1 (а) ч и 6 ч (б)

представлял переходный вариант, смесь гидрокси- и дигидрокси-форм. Курс применения препаратов составил 3 недели. После окончания срока введения у животных транскардиаль-но забирали кровь для анализа на ферменты печени (АСТ, АЛТ, щелочную фосфатазу), билирубин, триглицериды, общий холестерин, ЛПВП. Исследование проводили на приборах Olympus AU-480, Sysmex XS-500i и Alifax Roller 10 Plus.

Содержание животных осуществлялось в соответствии с нормативным документом СП 2.2.1.321814 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. № 51. Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава РФ (протокол № 656 от 23.04.2019).

Статистическая обработка данных, полученных на животных, проводилась с использованием метода многомерного дисперсионного анализа (MANOVA) в компьютерной программе SPSS.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

После 1 часа механоактивации порошок представляет собой отдельные частицы сферической формы с преимущественным размером 60 нм. Максимальный размер отдельных крупных частиц не превышает 250 нм. Через 3 ч механоактивации происходит агрегирование частиц с формой эллипсоида вращения и размером 80–50 нм и формирование неустойчивых агрегатов размером до 1,5 мкм, которые разрушаются при сканировании кремниевым зондом. Через 6 ч механоактивации формируются слоистые агрегаты частиц размером 5 мкм и более. Отдельные слои собраны из частичек в форме дисков средней толщиной 100 нм и диаметром 400–900 нм (рис. 1).

Анализ NEXAFS-спектров показал, что пространственно-групповая симметрия элементарной ячейки исходного порошка оротата калия соответствует орторомбической Cmma с размерами элементарной ячейки a = 6,842 Å, b = 12,535 Å и c = 7,685 Å. В процессе механо- активации оротата калия тип кристаллической структуры не изменяется.

Методом РФЭС выявлено уширение дифракционных линий (рис. 2), что свидетельствует о снижении размеров кристаллитов и росте уровня микроискажений (e0) решетки.

5          15          25          35

2Ө (degree)

Рис. 2. Дифрактограммы исходного (1) и механоактивированных оротатов калия в течение 1 ч (2), 3 ч (3), 6 ч (4)

Уже после 60 мин механоактивации про-

нилось химическое строение оротата. В спек-

слеживается преимущественная ориентировка кристаллитов вдоль плоскостей (200) и (201).

трах исходного образца доминируют пики от групп –N= и С=О, т. е. доминирует оксо-форма

При этом молекулы оротата калия ориентиро-

оротата калия. Механоактивация в течение 1 ч

ваны (упакованы в молекулярном кристалле

приводит к уменьшению интенсивности пиков

в виде ламелей) параллельно плоскости (100) .

Очевидно, что возросший вклад в интенсивность отражений от данного набора плоскостей обусловлен характером диспергирования

от С=О и –NH- групп и появлению достаточно интенсивных линий от С-ОН и –N= групп, что свидетельствует о формировании гидроксиформы оротата калия. После 6 ч механоакти-

оротата калия.

Анализ РФЭС спектров свидетельствует

вации пики С-ОН и –N= доминируют, свидетельствуя о том, что в образце доминирует ди-

также, что в результате механоактивации изме-

гидрокси-форма оротата калия (рис. 3).

CH

O=C-N

C-OH

O-C=N

O=C-N

ar cyc

O-C=N

CH2

C-OH

O=C-N ar cyc

O=C-N

O=C-N

CH

C-OH

O=C-N ar cyc

O-C=N

280     285     290      ^{395        400        405}       530

Binding energy (eV)

Рис. 3. Рентгеноэлектронные C1s-, O1s-, N1s-спектры исходного и механоактивированного оротата калия: 1 – исходный препарат, 2 – механоактивированный в течение 1 ч, 3 – механоактивированный в течение 6 ч

Таким образом, механоактивация 6 ч не изменяет кристаллической структуры калия орота-та, наблюдается лишь уменьшение размеров частиц и кристаллитов, приводит к изменению таутомерной структуры аниона оротата (превращение оксо-формы в гидрокси- и дигидрокси-форму). Обе формы устойчивы и сохраняются в эксикаторе в течение нескольких месяцев, что позволило провести испытания препаратов на животных.

Введение препаратов крысам с индуцированной гепатопатией (ИГ) сопровождается сни- жением уровня аланинаминотрансферазы во всех группах по сравнению с ИГ: в 1,51 раза у крыс, которым вводили ОрКа-1, в 1,79 раз – ОрКа-2, в 2,14 раза – ОрКа-3 (р < 0,05) (табл. 1). Уровень аспартатаминотрансферазы снижается только в группе с введением гидроксиформы (в 1,26 раза, р < 0,05). Щелочная фосфатаза в группах ОрКа-1 и ОрКа-3 повышается, в отличие от ОрКа-1.

Количество билирубина достоверно снижено только в группе, получавшей гидроксиформу оротата калия.

Таблица 1

Показатели, экспериментальные группы	АЛТ ед./л	АСТ ед./л	ЩФ мккат/л	Билирубин ммоль/л
ИГ	65,3 ± 7,70	162,08 ± 29,17	3,82 ± 0,35	0,085 ± 0,0089
ОрКа-1	43,5 ± 4,50	172,5 ± 40,5	5,18 ± 0,30*	0,051 ± 0,0089
ОрКа-2	36,5 ± 8,69	119,5 ± 6,84*	4,23 ± 0,31	0,034 ± 0,009*
ОрКа-3	30,5 ± 5,5*	143,0 ± 10,0	4,98 ± 0,32*	0,053 ± 0,0072

* Различия достоверны в отношении показателей группы сравнения с индуцированной гепатопатией (ИГ) при р < 0,05.

Данные биохимических анализов у животных с индуцированной гепатопатией после введения таутомерных форм оротовой кислоты

Липидный спектр крови животных после введения таутомерных форм калия оротата лабораторным животным испытывает разнонаправленные изменения (табл. 2). В группе ОрКа-1 на 36,26 % в сравнении с ИГ повышаются триглицериды, на 22,52 % – общий холестерин, повышается индекс атерогенности в 1,47 раз (р < 0,05). Наиболее «удачной» выглядит ли- нейка липидов в группе с введением гидроксиформы (ОрКа-2): уровень триглицеридов снижается в 1,78 раз (р < 0,05). В группе ОрКа-3 по сравнению с ИГ индекс повышается на 50,57 %, что прогностически является неблагоприятным фактором в отношении развития атеросклеротических осложнений, обусловленных патологией печени.

Таблица 2

Показатели липидного спектра крови у животных с индуцированной гепатопатией после введения таутомерных форм оротовой кислоты

Показатели (ммоль/л), экспериментальные группы	Триглицериды	Общий холестерин	ЛПВП	Индекс атерогенности
ИГ	0,91 ± 0,17	1,51 ± 0,13	0,83 ± 0,16	0,87 ± 0,05
ОрКа-1	1,24 ± 0,76*	1,85 ± 0,55	0,81 ± 0,10	1,28 ± 0,24*
ОрКа-2	0,51 ± 0,14*	1,57 ± 0,15	0,77 ± 0,16	1,06 ± 0,09*
ОрКа-3	0,53 ± 0,098*	1,33 ± 0,13*	0,55 ± 0,08*	1,31 ± 0,27*

*Различия достоверны в отношении показателей группы сравнения с индуцированной гепатопатией (ИГ) при р < 0,05.

Проведенный анализ MANOVA показал статистически значимые различия в уровнях ферментов в зависимости от группы F (12, 81) = 3,638, p < 0,0001; След Пиллаи = 1,051, частичная эта-квадрат = 0,350. Принадлежность к группе оказывает статистически значимое влияние на уровни: АЛТ – F (3, 32) = 2,930, p = 0,05;

частичная эта-квадрат = 0,239, АСТ – F (3, 32) = 6,779, p = 0,001; частичная эта-квадрат = 0,421, триглицериды – F (3, 32) = 3,640, p = 0,025; частичная эта-квадрат = 0,281.

Для холестерина статистическая значимость выявлена не была F (3, 32) = 2,506, p = 0,079; частичная эта-квадрат = 0,212.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом механоактивации получены ме-тастабильные, устойчивые формы оротовой кислоты (оротат калия): гидрокси- (механообработка в течение 1 ч) и дигидрокси-формы (механообработка в течение 6 ч). Ответ организма животных на введение таутомеров оро-товой кислоты показал, что эффективность ме-ханоактивированных препаратов была выше, чем исходной оксо-формы оротата калия. Анализ внутригрупповых различий (MANOVA) указывает на преимущество гидрокси-формы оро-товой кислоты перед оксо- и дигидроксиформой. Наибольшая гидрофобность характерна гидрокси-форме оротат-аниона, во-первых, за счет образования ароматического гетероциклического кольца, во-вторых, за счет появления ОН-групп. Гидрофобность является одним из факторов, обеспечивающих биодоступность лекарственного вещества. Оротат-анион гидрокси-формы имеет все четыре функциональные группы, которые имеют разную химическую природу (-N=, C=J, -NH-, C-OH) что расширяет возможность взаимодействия с клеточной мембраной по сравнению с оксо- и дигидрокси-формами, в каждой из которых функциональные группы только двух типов (-N= и C=O в оксо-форме, –NH- и C-OH в дигидроксиформе). Полученные данные могут быть положены в основу клинической апробации гидрокси-формы оротовой кислоты, как наиболее активной формы препарата.