Chromatography-mass spectrometric analysis of peripheral blood for diagnostic and prognostic evaluation of patients with obstructive jaundice

Известно, что у больных механической желтухой происходят выраженные изменения не только в печеночном звене (холестаз, холемия,холангит, печеночная энцефалопатия), но и глубокие дисбиотические нарушения вследствие ахолии, токсические метаболиты которых приводят к бактериальной транслокации и эндотоксемии, усугубляя при этом печеночную недостаточность.

Целью исследования – изучить возможности хромато-масс-спектрометрического анализа периферической крови для диагностической и прогностической оценки больных механической желтухой.

Газохромато-масс-спектрометрические исследования токсических кишечных метаболитов проводили у 120 больных разного пола и возраста по 4-м направлениям: (1) исследование летучих жирных кислот (жирные кислоты с короткой цепью, далее, короткоцепочечные жирные кислоты – КЖК) и токсических метаболитов в сыворотке крови с определением хроматографического показателя интоксикации; (2) определение производных билирубина и короткоцепочечных жирных кислот непосредственно в желчи у больных; (3) выявление аммиака и его токсических производных в сыворотке крови и (4) определение сигнальных молекул чувства кворума (Quorum Sensing) – активаторов кооперативного поведения микроорганизмов: лактонов, хинолонов, фурановых эфиров и родственных соединений в сыворотке крови.

Предварительно была разработана рабочая схема хроматографического и масс-спектрометрического исследования биологического материала у больных механической желтухой различного генеза. При исследовании периферической крови осуществляли пробоподготовку с экстракцией соединений с помощью диэтилового эфира и гексана. Этим методом определяли КЖК и метаболиты группы фенолов и крезолов, фенилкарбоновые и оксифенилкарбоновые кислоты, ди- и полиамины, ароматические амины, изожирные высшие кислоты.

Для определения молекул QS-системы использовали масс-селективный детектор MSD- 5375 с определением масс-спектров сигнальных соединений и скрининговым исследованием больных (лактоны, хинолоны и фурановые эфиры). Желчь больных исследовали с помощью экстракции на твердофазном носителе и экстракцией диэтиловым эфиром с прямым вводом в хромотографах, также осуществляли перевод в триметил-силильные соединения (ТМС) с последующей хромато-масс-спектро-метрией метаболитов билирубина. Аммиак и его производные определяли по методике Branhova M. et al. (1978) в модификации Ежелевой А.Е с соавт. (1978).

Результаты и обсуждение

На основании использования методов многомерной статистики был выстроен приоритетный ряд хроматографических показателей, используемых нами в данной работе (табл. 1).

По величине удельного веса (на основании факторного анализа) на первые 15 мест претендуют следующие хроматографические показатели: на места 1-е, 3-е и 5-е с величинами удельного веса – 0,976, -0,943 и 0,937 соответственно определены оксифенилкарбоновые кислоты, ароматические амины и изожирные высшие кислоты, определяющие по нашему мнению степень гипоксических изменений в ткани печени (оксифенилкарбоновые кислоты), а также метаболические нарушения на фоне печеночной недостаточности (ароматические амины) и наличием септического компонента (изожирные высшие

Бекбауов С.А., Липницкий Е.М., Истратов В.Г.

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ БОЛЬНЫХ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ

Табл. 1. Приоритетный ряд основных хроматографических показателей у больных механической желтухой (по данным факторного анализа)

№ Наименование показателя Величина удельного веса 1 оксифенилкарбоновые кислоты 0,976 2 пропионовая кислота 0,958 3 ароматичесие амины 0,943 4 масляная кислота 0,941 5 изожирные высшие кислоты 0,937 6 изовалериановая кислота 0,923 7 фурановые эфиры 0,911 8 изокапроноая кислота 0,907 9 2-пропанамид 0,893 10 фенилкарбоновые кислоты 0,878 11 хинолоны 0,871 12 лактоны 0,865 13 аммиак 0,856 14 фенолы 0,841 15 крезолы 0,836 16 коэффициент анаэроб\аэроб 0,822 17 метионин сульфат 0,819 18 уксусная кислота 0,811 19 ди-и полиамины 0,803 20 N-N-диметил-алкил-амин 0,798 21 ассоциир.с альбумином билирубин 0,767 22 билирубин диглюкоронид 0,763 23 валериановая кислота 0,758 24 билирубин-моно-2-глюкоронид 0,732 25 капроновая кислота 0,726 26 мезобилирубин 0,721 27 комплекс билирубина+фосфолипиды 0,711 28 комплекс билирубина+ пироллы 0,703 кислоты). На 2-ое, 4-ое, 6-ое и 8-ые места с величинами удельного веса – 0,958; 0,941; 0,923 и 0,907 соответственно определены КЖК – пропионовая, масляная, изовалери-ановая и изокапроновая, являющиеся классическими метаболитами анаэробной микрофлоры, четко присутствующими в данном биотопе анаэробной инфекции в организме (речь идет о кишечной микрофлоре, определяющей преобладание микробных анаэробных метаболитов одонтогенной микрофлоры типа фузобактерий и ротовых трепонем). На места 9-е, 10-е и 13-е с величиной удельного веса 0,833; 0,878 и 0,856 соответственно претендовали 2-пропанамид, фенилкарбоновые кислоты и аммиак, которые также в определенной степени свидетельствовали о нарушениях метаболизма в гепатогастродуоденальной зоне. На 7-е, 11-е и 12-е места с величиной удельного веса 0,911; 0,871 и 0,865 соответственно претендовали такие показатели как фурановые эфиры, хинолоны и лактоны – представители микробных сигнальных соединений – аутоиндукторов – активаторов кооперативной чувствительности, определяющие готовность к обьединению разных групп грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (включая условно-патогенные и сапрофиты), при запуске с помощью QS-cистемы «Quorum Sensing»

генов патогенности и развития генерализованного инфекционного процесса 14-е и 15-е места с величинами удельного веса 0,841 и 0,836 соответственно занимает фенолы и крезолы, определяющие степень развития почечной недостаточности.

Существенную роль в патогенезе септических процессов у больных механической желтухой играет полиорганная недостаточность, и прежде всего печеночно-почечная (фенолы и крезолы), а также ди-, и полиамины , и N-N-диметил-алкил-амин, которые претендовали на 19-е и 20-е места с величинами удельного веса – 0,803 и 0,798 соответственно. На 21-е, 22-е, 24-е, 26-е, 27-е и 28-е места претендовали ассоциированные с альбумином формы билирубина, билирубин диглюкоронид, билирубин моно-2-глюкоронид, мезобилирубин, комплексы билирубина с фосфолипидами и комплексы билирубина с пироллами с величинами удельного веса – 0,767; 0,763; 0,732; 0,721; 0,711 и 0,703 соответственно. Эти соединения определяли достаточно сложные механизмы связывания и выведения билирубина из организма, особенности его метаболизма в организме.

Заключение

Таким образом, хроматографические и хромато-масс-спектрометрические исследования периферической крови у больных механической желтухой позволяют оценить степень печеночной недостаточности, участие токсических метаболитов кишечной микрофлоры в патологическом процессе с опасностью развития генерализованной инфекции активизированной собственной дисбиозной грампо-ложительной и грамотрицательной микрофлорой.