Хромосомные аберрации в тканях желудка при хроническом эрозивном гастрите как потенциальный маркер ранней злокачественной трансформации клеток

Материал и методы

Средний возраст пациентов на момент выявления заболевания был 53,9 года (28–76 лет). Забор материала был проведен в 2007–2009 гг. С момента получения необходимого материала для анализа и до окончания исследования прошел год. На протяжении трех лет получения биоптатов и на момент подготовки настоящей публикации (август 2010 г.) не было зарегистрировано повторных обращений данных пациентов по поводу ухудшения состояния здоровья в клинику НИИ онкологии СО РАМН.

Для детекции хромосомных аберраций был использован метод сравнительной геномной гибридизации (CGH) [9]. Образцы геномной ДНК были получены из биопсийного материала с помощью обработки протеиназой К с последующей фенол-хлороформной экстракцией ДНК [3]. Мечение тестовой и контрольной ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови здорового индивида мужского пола, осуществлялось в ходе реакции ник-трансляции с помощью дизоксирибонуклеотидов, меченых флуорохромами TAMRA (красный) и Fluorescein (зеленый) соответственно [12]. Переосаждение смеси контрольной и анализируемой ДНК осуществлялось в присутствии 40-кратного избытка С0t1-DNA в течение 24 ч при –20°С, после чего проводилось растворение зондов в гибридизационной смеси, в состав которой входил 100 % формамид, декстрансульфат и спермальная ДНК лосося. После денатурации ДНК-зондов и препаратов хромосом осуществлялась конкурентная гибридизация меченых ДНК-библиотек с метафазами здорового индивида в течение 72 ч

Таблица

Хромосомные нарушения в клетках эпителиальной ткани при хроническом эрозивном гастрите

при 37°С. Детекцию гибридизационых сигналов проводили с использованием люминесцентного микроскопа «Axioskop 50» («Carl Zeiss», Германия) с CCD-камерой с набором специфичных светофильтров. Анализ гибридизационных профилей осуществлялся с помощью программы «CGHView 3.0» («Applied spectral imaging», USA). Для повышения разрешающей возможности метода использовали опцию CGH высокого разрешения (High Resolution CGH, HR-CGH). Принцип HR-CGH заключается в использовании доверительного интервала, предварительного построенного на основе сравнительной гибридизации нескольких контрольных образцов ДНК с метафазами, полученными от здорового индивида. При проведении исследования нахождение гибридизационного профиля в пределах доверительного интервала рассматривается как норма, тогда как выход за границы интервала принимается в качестве аномалии – амплификации или делеции. Разрешающая способность такого подхода составляет около 6 млн п.о. В анализ гибридизационного профиля для каждого пациента включалось 10 метафазных пластинок. Во избежание ложноположительных результатов прицентромерные регионы хромосом 1, 9, 15, 16, содержащих крупные гетерохроматиновые блоки, были исключены из анализа. Кроме того, в анализе не учитывались теломерные районы всех хромосом набора, в которых поведение гибридизационного профиля является чрезвычайно вариабельным.

Результаты и обсуждение

Нарушения хромосомного материала были выявлены в восьми из десяти образцов хронического эрозивного гастрита (таблица). Наиболее общими аномалиями были амплификации в участках 3p12-23 (37,5 %) с минимальными перекрывающимися регионами 3p14 и 3p22, а также 3q13.1-27 (37,5 %) с общими регионами 3q25-26.2 и 3q26.1. Далее следовали амплификации в участках 2p12-23 (25 %) с минимальным регионом 2p16; 2q14.1-32 (25 %) с минимальным общим регионом 2q31; 4q24-25 (25 %), для которой был характерен наименьший перекрывающийся регион 4q25, а также амплификации в участках 6q21 (25 %) и 6q22-24 (25 %). Наряду с сегментными анеуплоидиями в одном из обследованных случаев (№ 7) была выявлена трисомия по хромосоме 19.

Следует отметить, что частота и спектр нарушений хромосомного материала, несмотря на наличие некоторых общих аномалий хромосом, значительно варьируют внутри исследуемой группы. Данный факт может быть объяснен наличием различных мутантных клеточных клонов в отдельно взятом биоптате, а также контаминацией нормальными клетками, что, в свою очередь, может являться причиной невозможности детекции некоторых аномалий. Кроме того, возможно, что развитие хронического эрозивного гастрита не всегда сопровождается нарушениями хромосомного материала на стадии воспалительной инфильтрации и гиперплазии, как показано для двух из десяти исследованных нами случаев. И напротив, значительный уровень хромосомных нарушений, в частности амплификаций, у трех пациентов (№ 5, 7, 8) показывает предположительно более высокий риск малигнизации клеток слизистой по сравнению с остальной группой. Анализируя разнообразие хромосомных аномалий, следует иметь в виду, что полученные генетические профили представляют собой картину нарушений хромосомного материала на определенном временном этапе развития патологического процесса. Кроме того, следует отметить, что результатом CGH-анализа являются данные не о кариотипе какой-то определенной группы клеток, а о комплексных нарушениях в нескольких клеточных клонах, каждый из которых имеет свой набор аберраций вследствие определенных мутационных событий.

Данная работа поддержана государственным контрактом № П1706 Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.