Идентичность генов устойчивости к расе G заразихи у линий подсолнечника разного происхождения

Введение. В производстве растительного масла одной из наиболее востребованных культур является подсолнечник ( Helianthus annuus L.). В силу своих биологических характеристик, культура обладает широким спектром адаптивных особенностей, спрос на продукты ее переработки увеличивается с каждым годом [1]. Заразиха кумская ( Orobanche cumana Wallr.) относится к высшим растениям и является одним из наиболее существенных биотических факторов, снижающих урожайность подсолнечника [2]. Этот облигатный паразит не имеет собственных корней и листьев, лишен хлорофилла. Проросток семени заразихи врастает в корень подсолнечника, формируя внутри него гаусториальный орган, с помощью которого потребляет водно-минеральные и органические вещества из сосудистой системы растения-хозяина [2]. Основным средством борьбы с паразитом выступает селекция на устойчивость к нему. Этот процесс является непрерывным, так как появление новой, более вирулентной расы заразихи сводит на нет предыдущие 4

усилия селекционеров [3]. В настоящее время в популяциях заразихи в РФ и других странах присутствуют расы E, F, G, H [4; 5; 6; 7]. Во ВНИИМК постоянно проводится мониторинг расовой принадлежности семян заразихи с разных полей Российской Федерации для правильного размещения возделываемого сортимента подсолнечника. Так, показано, что в 2019 г. в регионах Ростовской, Воронежской, Белгородской областей и Краснодарского края ещё имелись поля с наличием рас Е или F, но с примесью высоковирулентного биотипа G, который на большинстве полей РФ уже стал доминирующим [7]. Таким образом, актуально создание гибридов и сортов подсолнечника, устойчивых к расе G заразихи. У подсолнечника в отношении O. cumana описаны как качественно, так и количественно (QTL) наследуемые гены резистентности [8]. Устойчивость к расе G обеспечивается одним доминантным [9] или, напротив, одним рецессивным геном [10; 11]. Во ВНИИМК с использованием различных источников генетического разнообразия подсолнечника был создан ряд инбред-ных линий разного происхождения, проявляющих иммунитет к расе G [12]. Устойчивость к данной расе контролируется у этих линий одним геном с неполным доминированием [13]. На основе этих доноров устойчивости уже создаются новые линии и гибриды подсолнечника, поскольку этот тип устойчивости является наиболее предпочти-тельным из-за простоты отбора [14; 15]. Но такая устойчивость может быть со временем преодолена быстро возникающими в современных условиях возделывания культуры новыми расами патогена [16]. Требуются новые стратегии создания устойчивого к паразиту селекционного материала, такие как пирамидирование основных генов или сочетание качественных и количественных механизмов устойчивости [8]. В связи с этим необходимо постоянно искать новые источники устойчивости и комбинировать имеющиеся гены в случае, если они не являются идентичными. Цель данного исследования – установить, являются ли идентичными гены устойчивости к расе G заразихи у линий подсолнечникам селекции ВНИИМК RG, RGP1, RGP2, RGВ, RGL1, RGL2 и RGM.

Материалы и методы. Материалом исследования служили линии подсолнечника разного происхождения – доноры устойчивости к расе G заразихи: RG, RGP1, RGP2, RGВ, RGL1, RGL2, RGM [13]. Семена заразихи для исследований были собраны на полях Боковского и Мо-розовского районов Ростовской области и идентифицированы как раса G с помощью линий-дифференциаторов.

Гибриды первого поколения от попарных скрещиваний линий получали в теплице. Принудительное самоопыление проводили с использованием индивидуальных изоляторов. При гибридизации использовали ручную кастрацию. Гибриды второго поколения получали в полевых условиях, путём самоопыления растений гибридов F 1 .

Растения испытывали в теплице на устойчивость и восприимчивость к заразихе, применяя метод ранней диагностики А.Я. Панченко [17]. Инфекционный фон создавался внесением семян заразихи в короба с почвенно-песчаной смесью из расчета 200 мг на 1 кг смеси. Выращивали растения подсолнечника при температуре 25–27 °С и 16-часовом фотопериоде. Через 25–30 дней после появления всходов растения выкапывали и проводили учет клубеньков или побегов заразихи на их корнях. В качестве контроля был использован сорт ВНИИМК 8883, восприимчивый ко всем расам O. сumana. Восприимчивыми считались растения, на корнях которых было обнаружено более пяти клубеньков или сформировавшихся побегов заразихи, как рекомендовано [18]. К устойчивым относили растения на корнях, которых было обнаружено пять и меньше клубеньков заразихи. Для определения степени поражения подсчитыва- ли среднее количество клубеньков заразихи на одно пораженное растение. Математическую обработку проводили с использованием χ2-критерия соответствия фактических расщеплений теоретически ожидаемым при дигибридных скрещиваниях [19].

Результаты и обсуждение. В предыдущих исследованиях нами было получено семь гетерозиготных поколений F 1 и F 2 от попарного скрещивания устойчивых линий друг с другом: RG × RGP1, RG × RGM, RG × RGL1, RG × RGB, RGМ × RGL1, RGB × RGL1, RGP2 × RGL2, и показано, что гены устойчивости могут быть аллельными [20]. В данном исследовании было получено еще 13 комбинаций скрещивания для завершения теста на ал-лелизм. Перед проведением теста линии были предварительно оценены на пораженность расой G заразихи. В основном линии поражались заразихой в малой степени (пять и менее клубеньков заразихи на одно растение подсолнечника) или не поражались совсем [20]. Растения подсолнечника с небольшим числом особей заразихи на корнях условно могут быть отнесены к резистентным [14; 18].

Как было сказано выше, в ходе проведения теста на аллелизм генов устойчивости были получены 13 гетерозиготных семей F 1 и F 2 от попарного скрещивания устойчивых линий друг с другом (табл. 1). На устойчивость к расе G заразихи было оценено от 11 до 33 растений каждой комбинации F 1 . Результаты поражения гибридных растений подсолнечника представлены в таблице 1.

Количество клубеньков на пораженное растение не превышало пять.

Среди испытанных 13 комбинаций не было ни одной, не поразившейся заразихой. Наименьший процент пораженных растений показали комбинации RG × RGL2 и RG × RGP2 – 9 и 7 соответственно. Гибридная комбинация RGP1 × RGP2 показала наибольший процент пораженных растений – 63. Но несмотря на такие 5

различия количеств пораженных растений в испытываемой выборке, степень поражения была небольшой у всех гибридных комбинаций – от 1,0 до 1,8 (табл. 1). Таким образом, первое поколение гибридов является устойчивым, с неполным доминированием резистентности.

Таблица 1

Поражение расой G заразихи растений подсолнечника 13 гибридных комбинаций F 1 от попарного скрещивания устойчивых линий

Гибридная комбинация	Количество растений, шт.			Поражено растений, %	Степень поражения, шт.
	всего	непо-раженных	поражен-ных
RGL2 × RGB	28	21	7	25	1,8
RGL2 × RGP1	15	7	8	53	1,5
RGL1× RGL2	11	6	5	45	1,0
RGL1 × RGP2	14	6	8	57	1,8
RGP1 × RGB	29	13	16	55	1,5
RGP1 × RGP2	33	12	21	63	1,4
RGP2 × RGB	27	16	11	40	1,0
RGL1 × RGP1	28	14	14	50	1,5
RG × RGL2	21	19	2	9	1,0
RG × RGP2	13	12	1	7	1,0
RGM × RGL2	29	20	9	31	1,1
RGM × RGP1	16	9	7	44	1,1
RGM × RGP2	11	9	3	27	1
Контроль	10	0	100	100	87

*Степень поражения – среднее количество клубеньков заразихи на пораженное растение

Для определения идентичности генов устойчивости у данных комбинаций были получены и проанализированы потомства F 2 от данных гибридов (табл. 2, 3). В таблице 2 представлены результаты поражения расой G заразихи растений подсолнечника 13 гибридных комбинаций F 2 от попарного скрещивания устойчивых линий. Не было обнаружено комбинаций без поражения заразихой. Но количество восприимчивых растений, то есть с количеством клубеньков паразита на корнях больше пяти, не превышало восьми растений. Исключением явилась комбинация скрещивания F 2 (RGL1 × RGP1), у которой количество восприимчивых растений составило 15. В общем степень поражения растений особями паразита была небольшой – от 1,0 до 3,4.

Таблица 2

Поражение расой G заразихи растений подсолнечника 13 гибридных комбинаций F 2 от попарного скрещивания устойчивых линий

Гибридная комбинация	Количество растений, шт.				Степень поражения, шт.
	всего	непо-раженных	поражённых, с количеством клубеньков
			5 и меньше	больше 5
RGL2 × RGB	304	261	43	0	2,3
RGL2 × RGP1	369	225	143	1	1,8
RGL1 × RGL2	363	283	79	1	1,6
RGL1 × RGP2	420	224	188	8	3,5
RGP1 × RGB	380	181	196	3	2,3
RGP1 × RGP2	285	185	99	1	1,6
RGP2 × RGB	395	312	83	1	2,0
RGL1 × RGP1	375	115	245	15	3,4
RG × RGL2	205	153	52	0	1,1
RG × RGP2	262	165	96	1	1,9
RGM × RGL2	94	74	20	0	1,2
RGM × RGP1	7	4	3	0	1,0
RGM × RGP2	10	7	3	0	1,0
Контроль	10	0	10	100	79,0

Количество растений у гибридов F 2 (RGM × RGP1) и F 2 (RGM × RGP2) было слишком мало для расчёта χ² -критерия соответствия фактических расщеплений теоретически ожидаемым при дигибрид-ных скрещиваниях (7 и 10 соответственно), поэтому они были исключены из дальнейшего анализа. Для потомств остальных 11 гибридов был рассчитан χ² -критерий (табл. 3).

Таблица 3

Анализ идентичности генов устойчивости к расе G заразихи в F 2 при попарном скрещивании устойчивых линий подсолнечника

Комбинация скрещивания	Всего растений, шт.	Количество растений, шт.		Ожи-дае-мое соот-ношение		χ2	df	Р
		устой-чи-вых	вос-при-им-чивых
RGL2 × RGB	304	304	0	15 :	1
RGL2 × RGP1	369	368	1	15 :	1	22,5	1	<0,05
RGL1 × RGL2	363	362	1	15 :	1	21,9	1	<0,05
RGL1 × RGP2	420	412	8	15 :	1	13,5	1	<0,05
RGP1 × RGB	380	377	3	15 :	1	21,9	1	<0,05
RGP1 × RGP2	285	284	1	15 :	1	16,9	1	<0,05
RGP2 × RGB	395	394	1	15 :	1	24,5	1	<0,05
RGL1 × RGP1	375	360	15	15 : 1		3,2	1	0,10– 0,05
RG × RGL2	205	205	0	15 :	1
RG × RGP2	262	261	1	15 :	1	15,6	1	<0,05
RGM × RGL2	94	94	0	15 :	1

Ожидаемое теоретическое расщепление в F 2 при дигибридных скрещиваниях, при условии, что оба гена доминантные, независимо наследуемые и не аллельные, 15 устойчивых к 1 восприимчивому [19]. Для восьми комбинаций было обнаружено два фенотипических класса. Для остальных трех комбинаций скрещивания (RGL2 × RGB), (RG × RGL2), (RGМ × RGL2) в потомстве F 2 расщепления обнаружено не было, и χ² для таких комбинаций не считается. Для комбинации F 2 (RGL1 × RGP1) фактически наблюдаемое расщепление соответствовало теоретически ожидаемой модели 15 : 1. Величина χ² находилась в пределах от 0,32 до 0,69, что подтверждает гипотезу о контроле устойчивости у каждой из изучаемых линий неаллельными генами с вероятностью 0,10–0,05. Для остальных семи комбинаций значения χ² были больше допустимых при вероятности 0,05, что указывает на то, что гены устойчивости к расе G заразихи у данных линий являются идентичными.

Линии с предположительно неаллельными генами устойчивости RGL1 и RGP1 в скрещиваниях с другими линиями показали отсутствие расщепления в F 2. Следовательно, RGL1 и RGP1 тоже обладают идентичным геном, несмотря на достоверность гипотезы о неаллельности их генов устойчивости. В предыдущем исследовании для F 2 (RGM × RGL1) и F 2 (RGB × RGL1) была подтверждена гипотеза о контроле устойчивости у каждой из изучаемых линий неаллельными генами с вероятностью от 0,3 до 0,7 [20]. Но отсутствие расщепления в скрещиваниях с одной и той же линией RG позволило предположить, что линии RGM с RGL1 и RGB с RGL1 обладают идентичным геном. В той же работе нами приведены и различные гипотезы, объясняющие искажение фенотипического проявления признака в различных комбинациях скрещиваний: линии могут иметь один и тот же локус устойчивости, но, возможно, с разными аллелями; дополнительные

QTL с незначительным влиянием на устойчивость к расе G заразихи могут влиять на искажение фенотипического проявления признака в различных комбинациях скрещиваний из-за различного генетического окружения гена ус-устойчивости; возможно неправильное определение фенотипов растений как восприимчивых, поскольку классы восприимчивых и устойчивых растений определены условно; вероятно присутствие единичных, более вирулентных биотипов, чем раса G, заразихи среди семян паразита, используемых для создания инфекционного фона. Такие биотипы могут единично поражать линии, устойчивые к расе G [20].

Выводы. Таким образом, в результате проведенного теста на аллелизм доминантных генов устойчивости к расе G заразихи у линий подсолнечника селекции ВНИИМК (RG, RGP1, RGP2, RGВ, RGL1, RGL2, RGM) в 11 комбинациях скрещиваний подтверждена их идентичность.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Администрации Краснодарского края, грант №19-44-230025.