Идентификация атипичного пестивируса крупного рогатого скота в биологических образцах

Пестивирусные инфекции — одна из основных причин экономических потерь в молочном и мясном скотоводстве во всем мире. Наибольшую актуальность в настоящее время имеют инфекции, вызванные двумя прототипными членами рода: вирусами вирусной диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) 1-го и 2-го типов (BVDV1 и BVDV2). Инфицирование неимунных животных приводит к субклиническим инфекциям, иммуносупрессии, диарее, респираторным болезням, репродуктивной патологии и болезни слизистых оболочек у персистентно инфицированных телят (1-4).

Атипичные пестивирусы — новая, официально не классифицированная группа вирусов рода Pestivirus семейства Flaviviridae, имеющая в литературе различные названия: 3-й тип вируса ВД-БС КРС (BVDV3), атипичный пестивирус (HoBi-подобный) (5). Агент впервые выделен в Европе из эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, импортированной из Бразилии (6). Позднее он был обнаружен в эмбриональных сыворотках, полученных в Австралии, Мексике, США и расфасованных в Европе (7-10). Сообщалось о естественной инфекции крупного рогатого скота и буйволов, вызванной BVDV3 в Юго-Восточной Азии (11-12), Ита- лии (13-15), Индии (16). Инфекция BVDV3 имеет значительное сходство с ВД-БС КРС и может компрометировать программы ее контроля, в частности приводить к ложноположительным диагностическим результатам и снижению эффективности вакцинопрофилактики (5, 17). Из-за широкого использование эмбриональной сыворотки и торговли племенными животными возможен занос возбудителя в различные регионы мира (5, 18), в связи с чем актуальна разработка современных высокочувствительных и специфичных тестов для выявления вирусов этой группы, а также изучение их циркуляции на различных территориях, в том числе в России. В доступной отечественной литературе нам не удалось найти сообщения о разработке ПЦР для выявления атипичного пестивируса КРС.

Нами впервые в России разработан быстрый и чувствительный способ выявления и идентификации атипичного пестивируса КРС в биологических образцах, с использованием которого обнаружены и секвени-рованы нуклеотидные последовательности этого вируса в 7 сериях импортной эмбриональной сыворотки.

Целью исследований была разработка способа обнаружения атипичного пестивируса при помощи полимеразной цепной реакции в биологических продуктах и изучение его циркуляции среди домашних и диких жвачных животных.

Методика. Для расчета олигонуклеотидных праймеров проводили выравнивание известных нуклеотидных последовательностей BVDV1, BVDV2, BVDV3, опубликованных в GenBank, с помощью программы ClustalW (19). Использовали четыре штамма BVDV1 — NADL (AJ133738.1), Singer (DQ088995.1), Osloss (M96687.1), PT-810 (AY078406.1), два штамма BVDV2 — US890 (Z79772.1), Giessen-6 (AY379547.1), а также 4 штамма атипичного пе-стивируса — D32/00_'HoBi' (AY489116.1), Th/04_KhonKaen (NC_012812), SVA/cont-08 (FJ232692.1) и IZSPLV_To (HM151361.1). Химический синтез праймеров осуществляли амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U («Biosset», Россия). Их концентрацию в маточном растворе определяли спектрометрически.

РНК вируса выделяли с использованием коммерческого набора реагентов РИБО-преп (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора реагентов РЕВЕРТА-L (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Полученную суспензию кДНК разбавляли в 2 раза 1½ ТЕ-буфером (до 40 мкл) и использовали для постановки ПЦР. Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле в стандартном Трис-боратном буфере (рН 8,0) с бромистым этидием (0,4-0,5 мкг/мл). Результаты учитывали в УФ-свете (λ = 254 нм) на приборе Трансиллюминатор УВТ-1 («Биоком», Россия). Результаты считали положительными при получении фрагмента амплификации размером 320 п.н.

Положительные контрольные образцы (ПКО) получали методом молекулярной трансформации бактерии Escherichia coli плазмидой pDrive, содержащей специфические ДНК-вставки. Концентрацию плазмидной ДНК определяли при помощи набора реагентов Quant-iTdsDNA, HS («Invitrogen», США) на флуориметре QUBIT («Invitrogen», США); в конечном варианте она составила 0,333 мкг/мкл (7,4½10¹⁰ копий/мкл). Для оценки чувствительности реакции готовили 10-кратные разведения ПКО, которые исследовали в ПЦР. За аналитическую чувствительность принимали последнее разведение ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретировался как положительный. Специфичность реакции оценивали со штаммами Oregon C24VBVDV1, БЛ BVDV2 и Ши-Мынь вируса клас-1260

сической чумы свиней (коллекция СФНЦА РАН).

Для подтверждения специфичности полученных фрагментов РНК определяли их нуклеотидную последовательность с дальнейшей очисткой на сефадексе G-50 superfine («GE Healthcare», США). Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили по обеим цепям ДНК. Первичные данные секвенирования расшифровывали с помощью программы Sequencher v.4.0.5 («Gene Codes Corporation», США). Реакцию секвенирования осуществляли с использованием набора BigDye 3.1 («Applied Biosystems», США) в соответствии с указаниями фирмы-производителя. Реакционная смесь (объем 5 мкл) содержала 2 мкл раствора из набора для проведения секвенирующей реакции, 5 пкмоль олигонуклеотидного праймера и 0,5 мкг ДНК. Реакцию проводили в программируемом термостате GeneAmp PCR-system 6700 («Applied Biosystems Inc.», США) по следующей программе: 10 с при 96 °С, 15 с при 50 °С, 4 мин при 50 °С (30 циклов). После амплификации реакционную смесь очищали от невключившихся флуоресцентно меченных нуклеотидов очисткой на сефадексе G-50 superfine. Секвенирование проводили по обеим цепям ДНК. Первичные данные секвенирования (хроматограмм) расшифровывали с помощью программы Sequencher v.4.0.5. Для секвенирования использовали высококонсервативный регион пестивиру-сов 5'-UTR. Анализ нуклеотидных последовательностей синтезированных фрагментов проводили методами выравнивания с опубликованными последовательностями других штаммов BVDV-3 (в частности, BVDV3_D32/00 и BVDV3_Th/04_Khonkaen) в программе ClustalW (19).

Тестировали 18 серий эмбриональных сывороток КРС, изготовленных в Южной Америке, США и Новой Зеландии (соответственно, 12, 5 и 1). Исследовали культуры перевиваемых линий клеток коронарных сосудов теленка КСТ, почки теленка MDBK и Taurus, тестикул эмбриона коровы ТЭБ, почки кролика RK-13, почки африканской зеленой мартышки Vero, фибробластов мыши L929 и МФ, почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21, трахеи эмбриона бычка FBT, почки эмбриона овцы FLK, почки котенка FK-81 (коллекции научно-исследовательских институтов). Дополнительно изучали 10 живых вакцин для медицины и ветеринарии. Пробы биоматериала (внутренние органы, кровь, сыворотка крови) отбирали у животных разных половозрастных групп из хозяйств Новосибирской, Тюменской, Омской, Кемеровской и Курганской областей, Алтайского, Красноярского и Краснодарского края, Республики Казахстан, а также от северных оленей Таймыра и Ямала и маралов Алтайского края.

Дендрограммы строили без укоренения методом ближайшего соседа (Neighbor Joining, NJ) с использованием 2-параметрической модели Кимуры в программе MEGA v.4 (20). Для оценки достоверности топологии использовался бутстрэп-тест (1000 репликаций) (21).

Результаты. Для BVDV3 были найдены несколько видоспецифичных районов. С помощью программы Oligo v.6.31 внутри каждого мы подобрали олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие специфическую амплификацию его РНК. В результате предварительных испытаний наиболее удачными (по качеству получившихся ПЦР-продуктов) были праймеры, комплементарные позициям 9202-9218 и 9501-9521 генома прототипного штамма D32/00_'HoBi' (AB871953.1): SEQIDNO:1 — 5'-TTTGCAGCCGA-GCGTAG-3', SEQIDNO:2 — 5'-CCTCCTGCATACTGTCACCTT-3'. Дальнейшие исследования проводили с ними. Чувствительность разработанной ПЦР составила 7,4½10^-1 копий/мкл; фрагменты других вирусов в процессе реакции не амплифицировались. Большинство исследователей используют для секвенирования регион 5'-UTR. Это дает наиболее точные результаты, особенно в 1261

отношении распределения изолятов вирусов по видам или типам (генотипам). Из 5′-UTR последовательностей чаще всего выбираются праймеры (8, 10, 11, 18). Мы тоже использовали в качестве мишени этот регион. Полученные нами праймеры обладали чувствительностью и специфичностью, схожи- ми с описанными в литературе, а секвенирование выявило наличие вируса бразильской группы в исследованных партиях эмбриональной сыворотки.

Впервые Hobi-like вирус был выделен и охарактеризован в Германии H.G. Schirrmeier с соавт. (6) в партии эмбриональной сыворотки, собранной в Бразилии и расфасованной в Европе. Изолят, названный D32/00_'HoBi', был признан прототипным для бразильской группы вирусов. Затем идентифицировали генетически различающиеся подтипы, имеющие региональное распространение, в частности тайскую группу (11, 12). N. Mishra с соавт. (16) предположили существование третьей, индийской группы штаммов. Возможно наличие четвертой группы вирусов, выделенных за пределами индийского региона, в частности в Италии (13-15). То есть к настоящему

Биолот Э-15-02

Биолот Э-10-01

PAA Laboratories А15-101 (1)

PAA Laboratories А15-101 (2)

PAA Laboratories All-101

PAA Laboratories A15-101 (3)

PAA Laboratories A15-101 (4) --BVDV3 D32/00 --BVDV3 Th/04 Khonkaen

' 0,01 1

Филогенетическое древо, построенное без укоренения методом Neighbor Joining c использованием модели Кимуры в программе MEGA v.4. В узлах ветви показан коэффициент поддержки бутстрэп-теста. Пробы PAA Laboratories A15-101 (1-4) поступили из разных источников.

времени идентифицированы четыре генетических группы вируса. В доступной отечественной литературе имеется сообщение о выявлении атипичного пе-стивируса в коммерческой вакцине против чумы мелких жвачных животных на территории Республики Таджикистан (22). Мы выявили геном Hobi-like вируса в 7 образцах эм- бриональной сыворотки от двух производителей из Южной Америки (рис.). Согласно результатам филогенетического анализа, все изученные образцы группировались со штаммом D32/00_'HoBi' (бразильская группа).

Нами также было показано отсутствие BVDV3 в 10 живых вакцинах, предназначенных для иммунизации человека, продуктивных и мелких домашних животных, и 11 перевиваемых линиях культур клеток. Геном вируса не удалось выявить в 189 пробах внутренних органов и 1383 пробах сыворотки крови КРС различных пород, в том числе поступивших по импорту, в 168 пробах сыворотки крови северных оленей и 63 крови маралов. Несмотря на то, что мы не установили циркуляцию атипичного пестивируса на территории обследованных регионов, его присутствие в стране не исключается. С учетом контаминации 7 образцов эмбриональных сывороток, использовавшихся в течение нескольких лет в четырех научно-исследовательских институтах России, в том числе для производства вакцин, подобная возможность существует.

Таким образом, на основе ПЦР с обратной транскрипцией нами разработан высокочувствительный специфичный метод выявления и идентификации атипичного пестивируса в биологическом материале. Применение синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных позициям 92029218 и 9501-9521 генома референтного штамма D32/00_'HoBi' (AB871953.1), позволяет обнаруживать последовательности вируса с чувствительностью 7,4½10-1 копий/мкл. Установлена контаминация BVDV3 семи образцов эмбриональных сывороток из Южной Америки. Филогенетический анализ выявил сходство обнаруженных вирусов между собой и со штаммом BVDV3 D32/00_'HoBi' (бразильская группа). Мы не нашли доказательств циркуляции атипичного пестивируса среди домашних и диких животных на территории нескольких областей России и Республики Казахстан. Полученные данные подтверждают необходимость постоянного обновления и совершенствования методов диагностики пестивирусов КРС, пересмотра правил международной торговли эмбриональной сывороткой и строгого контроля их соблюдения.