Научные статьи \ Прикладные науки. Медицина. Технология \ Mедицинские науки \ Патология. Клиническая медицина \ Нервная система. Невропатология. Неврология

Идентификация геномных вариантов в генах морфогенеза нервной ткани, ассоциированных с развитием параноидной шизофрении (на материале российской популяции)

Автор: Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Величко А.Я., Драч М.Д., Сотская Е.А., Попов В.С., Рубина К.А., Парфененко М.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А.

Журнал: Сибирский вестник психиатрии и наркологии @svpin

Рубрика: Биологические исследования

Статья в выпуске: 1 (122), 2024 года.

Бесплатный доступ

Актуальность. Нарушение функции и экспрессии генов, вовлеченных в процессы закладки и развития головного мозга, считается одной из возможных причин возникновения психических заболеваний. Выявление таких генов и их патологических геномных вариантов открывает новые возможности к диагностике, профилактике и, возможно, лечению ряда психических расстройств.

Параноидная шизофрения, морфогенез нервной ткани, нейротрофические факторы, навигационные молекулы, секвенирование следующего поколения, аллель-специфичная полимеразно-цепная реакция

Короткий адрес: https://sciup.org/142240658

IDR: 142240658 | УДК: 616.895.7(470):631.523.11:631.523.13:612.8.05 | DOI: 10.26617/1810-3111-2024-1(122)-37-50

Текст научной статьи Идентификация геномных вариантов в генах морфогенеза нервной ткани, ассоциированных с развитием параноидной шизофрении (на материале российской популяции)

Рост числа психических и когнитивных нарушений представляет собой все более актуальную проблему для человечества и современного общества. Согласно данным ВОЗ, за 2022 г. число лиц, страдающих такими расстройствами, превысило 1 миллиард человек [1], что побуждает исследователей к необходимости установлени[я механизмов, лежащих в основе предрасположенности к развитию данных заболеваний, а также выработке подходов к их своевременной диагностике, профилактике и терапии. Современные концепции возникновения психических заболеваний важную роль отводят генетическим факторам [2], причем появляется всё больше публикуемых свидетельств о взаимосвязи процессов закладки, развития и созревания мозга с особенностями протекания психических процессов и высших психических функций у конкретного человека [3].

Процесс развития мозга является сложным, многоэтапным, требующим координированного взаимодействия множества молекулярных участников [4, 5], а искажение экспрессии и функции отдельных генов может нарушать структуру мозга и закладывать основу развития психических и когнитивных нарушений. Выявление таких генов, изучение функциональной значимости их геномных вариантов, разработка подходов к их своевременной идентификации и терапевтической коррекции представляют собой основн ые задачи молекулярной психиатрии.

В литературе встречается несколько исследований, посвященных выявлению ассоциации частот встречаемости отдельных геномных вариантов в российской популяции с предрасположенностью к развитию психических заболеваний [6]. Однако практически ни одно из них не было посвящено изучению геномных вариантов генов, участвующих в процессах закладки и развития головного мозга, как материальной основы интеллекта и психического здоровья.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам обследования пациентов с шизофренией и условно здоровых лиц российской популяции идентифицировать геномн ые варианты в генах морфогенеза головного мозга, потенциально ассоциированные с развитием параноидной шизофрении, как одной из наиболее распространенных форм шизофрении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все участники исследования принадлежали к европеоидной расе, не являлись кровными родственниками и проживали в России (жители Москвы и Московской области).

Диагноз параноидной шизофрении (коды по МКБ-10: F20.00 и F20.01) устанавливался врачом-психиатром в ходе клинического собеседования и психодиагностического тестирования на основании критериев, изложенных в клинических рекомендациях Российского общества психиатров «Шизофрения» [7].

Для выполнения исследования были сформированы две группы. В основную группу (ОГ) включен ы пациенты (n=102) с установленным диагнозом параноидной шизофрении, четверть (25,5%) из них имели отягощенн ый психиатрический семейн ый анамнез. Средний возраст пациентов ОГ составил 33 (26; 47) года. Мужчины (54%) преобладали по сравнению с женщинами (46%). Средняя продолжительность заболевания на момент исследования составила 8 (4; 17,8) лет. Средний возраст манифестации заболевания составил 23 (19; 29,8) года.

Критерии включения в группу сравнения (ГС): отсутствие признаков психического заболевания на момент обследования, отсутствие обращений в психиатрические учреждения в прошлом, неотя-гощенный психиатрический семейный анамнез. ГС по числу (n=103) обследованных была идентична ОГ. Средний возраст психических здоровых лиц был ниже, чем пациентов ОГ - 27 (24,5; 31,5) лет, женщины (68,9%) преобладали над мужчинами (31,1%). Здоровые доноры (n=5), имевшие отягощенный психиатрический семейный анамнез, не были включены в группу сравнения на этапе набора участников исследования.

Секвенирование следующего поколения (NGS) и аналитическая обработка данных

Геномную ДНК для проведения генетических исследований выделяли из ядросодержащих клеток крови пациентов с параноидной шизофренией и психически здоровых доноров с помощью набора для выделения ДНК из крови QiAamp DNA Blood Mini Kit (250) (Qiagen, #51106) в соответствии с рекомендациями производителя. Для полноэкзомного секвенирования были подготовлены ДНК-библиотеки 11 образцов геномной ДНК от пациентов с шизофренией, которые затем были переданы в ООО «Геноаналитика» для проведения полноэкзомного секвенирования.

Для оценки качества результатов секвенирования и предварительной обработки полученных последовательностей (удаление последовательности адаптера на 3'-конце, устранение избыточных прочтений и прочтений низкого качества) нами был применен биоинформативный анализ по методу PRINSEQ.

Прочтения экзомных последовательностей геномной ДНК были выровнены в соответствии с базой данных референсный геном человека GRCh37.p13/hg19 при помощи инструмента BWAMEM v. 0.7.17 [8]. При этом проводили одновременное удаление дубликатов прочтений с помощью инструмента для обработки коротких фрагментов секвенированной ДНК SAMtools rmdup.

Короткие генетические варианты идентифицировали и помечали с помощью геномного анализа GATK v. 4.1.7.0 HaplotypeCaller [9]. Значимость таких нуклеотидных замен предсказывали с помощью инструментов GATK tool CNNScoreVariants и snpEff в соответствии с рекомендациями разработчиков. Потенциальную патогенность идентифицированных геномных вариантов оцени вали с помощью программ SIFT and PolyPhen-2 на основании баз данных dbNSFP, Clinvar, OMIM и HGMD.

В данном совместном исследовании основным объектом для изучения являлись гены, вовлеченные в процессы морфогенеза мозговой ткани: гены навигационных рецепторов/молекул (ADIPOR1, CDH1, CDH2, CDH3, CDH4, CDH5, CDH6, CDH7, CDH8, CDH9, CDH10, CDH11, CDH12, CDH13, CDH14, CDH15, CDH16, CDH17, CDH18, CDH19, CDH20, CDH21, CDH22, CDH23, CDH24, CDH25, CDH26, CDH27, CDHR1, CDHR2, CDHR3, CDHR4, CD44, DCC, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, ERBB2, ERBB3, ERBB4, IL6R, IL6ST, ITGA3, ITGAV, ITGB1, NRP1, NRP2, PCDHGA12, PLAUR, PLXNA1, PLXNA2, PLXNA3, PLXNA4, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, UNC5A, UNC5B, UNC5C, UNC5D,

UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3, UNC5H4, UNC5H5), гены лигандов (ADIPOQ, CHRD, EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3, IL6, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NTN1, NTN3, NTN4, NTNG1, NTNG2, PLAU, RELN, SHH, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SEMA6C, SEMA6D, SEMA7A), гены нейротрофи : ческих факторов ( NGF, BDNF, NTF3, GDNF, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD) и их рецепторов (NTRK1, NTRK2, NTRK3, NGFR, GFRA1, GFRA3, RET), а также ассоциированные молекулы (PLAT, PLG) - в общей сложности 140 генов.

Гены белков, участвующих в синтезе, транспортировке, рецепции и обратном захвате нейромедиаторов, а также гены, связанные с выработкой антител и иммунологической толерантностью, для которых ранее также было показано участие в патогенезе психических и поведенческих расстройств [10, 11], в данном исследовании не изучали.

ARMS (Amplification-refractory mutation system)

Оценку распространенности геномн ых вариантов проводили с помощью опубликованного ранее метода ARMS (Amplification-Refractory Mu tation System) . В соответствие с ранее описанными рекомендациями [12] для каждой из мишеней было подобрано по 4 праймера, 2 из которых фланкировали идентифицированн ый однонуклеотидный полиморфизм, распознавая различные его варианты, а 2 внешних праймера отстояли от области мутации на расстоянии 100-250 нуклеотидов. Список использованных праймеров и параметров амплификации приведен в таблице 1.

Таблица1 1. Использованные олигонуклеотиды и параметры амплификации для ARMS-детекции отдельных аллельных вариантов в генах морфогенеза нервной ткани

1	2	3	4
eq 2	BDNF 6265J'	CT( ICAGTCTTTTTGTCTC VCGCC	62V, 300ii.li. f+rl, Т-аллель
	BDNF_6265_rl	’ fGACATCA^r fTGGCTGACACITICGAACAT A	62V, 300ii.li. f+rl, Т-аллель
	BDNF 6265 fl	CTGGTCCTCATCCAACAGCTCTTCTATCGC	62V, 199 н.п. fl+r, С-аллель
	BDNF_6265_r	TATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGC	62V, 199 н.п. fl+r, С-аллель
^ Si	CDH13_2724_f	CGGGGTCATTTGTGTTCTTTGTCTCCATGTCCT	63 V, 166 пн. f+rl. С-аллель
	CDH13_2724_rl	GCAGGCA A ATI TACC TGC ATG( HTGAAGCTGC A( iGTAG	63 V, 166 пн. f+rl. С-аллель
	CDH13_2724_fl	GAGAATGGCCCACAGATGCCTGGGCGTGATT	63V, 264 и. h. fl+r, Т-аллель
	CDII13_2724_r	CTTCAAGTTACATTCAATCCAATTGCCACACAAT	63V, 264 и. h. fl+r, Т-аллель
то 5 ^ ? о Q S гм ^ S - М U 1-1	CDU23_9947_f	TGGGCCAAAGGAGACGTGCGAGAG	64V, 170 n.H. f+r 1, А-аллель
	CDH23_9947_rl	CTCACCTGTCAGGGTCATCACTGAAGAAGTACT	64V, 170 n.H. f+r 1, А-аллель
	CDH23_9947_fl	GACAATGATGCAGGCACCTTTGGGGAAGTCGG	64V,270 п.и. fl+r, G-аллель
	CDH23_9947_r	GTGCCCCAGAGAGTTGAGGAGACTTGAC	64V,270 п.и. fl+r, G-аллель
	CDH23_7051_f	GCTCTCCTCCCAGAACGTGGGTGGAGGTAC	67V, 150 п н. f+rl, А-аллель
	CDH23_7051_rl	TCTCACCGCTGATGCGGTCCATGCGGAAGCT	67V, 150 п н. f+rl, А-аллель
	CDH23_7051_fl	CCTACTACATCACCGAGGGCAACAAGGACATAG	67V, 280 rj и.

	CDH23_7051_r	AAGGAGTTGTCAAGGATTCGCCTGCTGTGTG	fl+r, G-аллель
й » N ^ « q 3 U 3 2 ¹ и И i—i	CDH2_5840_f	GTGGCCATCCATTAATGTGGTCTGAAGCAAAGC	57,5°C, 182 п.н. f+rl, T-аллель
	CDH2_5840_rl	CAAGACAAAGAGACCCAGGAAAAGTGGCAAGTTA	57,5°C, 182 п.н. f+rl, T-аллель
	CDH2_5840_fl	CTCCTCAGTTAAGGTTGGCTTCAGGCTCAATTTTACTAC	57,5°C, 315 п.н. fl+r, С-аллель
	CDH2_5840_r	CCTTTAACCTAAGCAGGATATAGGTTTAAGTATTAGGGG	57,5°C, 315 п.н. fl+r, С-аллель
	CDH2_4294_f	GGTTAACAGAAATTCACATAAGCATTAAATTCCTTG	59,5°C, 202 п.н. f+rl, T-аллель
	CDH2_4294_rl	GTGTATCTTCACTGAGAAATTAAAGAACCAAGCAGAACA	59,5°C, 202 п.н. f+rl, T-аллель
	CDH2_4294_fl	GGAATGAATAAGGCAATTTTTGTTACCTGAAAGGAAAACATAAA	59,5°C, 308 п.н. fl+r, А-аллель
	CDH2_4294_r	GGGATCAGTGAATCAGATGTAATAAGGGCTCT	59,5°C, 308 п.н. fl+r, А-аллель
rr> 2 ° Q U M m	CDH3_3655_f	CTGCAGGTCTCCACCCTGGCAGGAAGC	64°C, 160 п.н. f+rl, С-аллель
	CDH3_3655_rl	GGATGGCTTGTCCACCCCACGTGCTCATAG	64°C, 160 п.н. f+rl, С-аллель
	CDH3_3655_fl	CCAAGACACAGCCCTTCCACAAATACATGAGGA	64°C, 246 п.н. fl+r, А-аллель
	CDH3_3655_r	GTCCCACTCCCTCCACTGTCCACAA	64°C, 246 п.н. fl+r, А-аллель
	CDH3_4409_f	CACTTGCTGTCTGCTGGTCCCTGAGTGAATG	66,5°C, 164 п.н. f+rl, А-аллель
	CDH3_4409_rl	ACAGGTAGTTAGGAGCGGCGGGTCCTGCTT	66,5°C, 164 п.н. f+rl, А-аллель
	CDH3_4409_fl	CAGAGAGGAAATGGAGGCTTGCAGCTGGCAATC	66,5°C, 241 п.н. fl+r, С-аллель
	CDH3_4409_r	CGGCTGCCCCACTCGTTCAGATAATCGTAATC	66,5°C, 241 п.н. fl+r, С-аллель
i ⁰⁰U £ ^Q 1	DCHSl_8443_f	GGCCACGCGGATTTCACCAGTGTAAGAGTC	66,5°C, 257 п.н. f+rl, G-аллель
	DCHSl_8443_rl	GGCCCCTAAGCACCACAGTGTCTGTCACCATCTC	66,5°C, 257 п.н. f+rl, G-аллель
	DCHSl_8443_fl	GGTGGGTGCATGGTCATTGACATCGCGCACTA	66,5°C, 143 п.н. fl+r, А-аллель
	DCHSl_8443_r	GCACAGCTGCAGCCTTGGACAGAGAACAG	66,5°C, 143 п.н. fl+r, А-аллель
^и 5 3 ’t 00 и	DCHS2_2714_f	CTTCCATATTTTATGGTGACAACATTACCTGAATATTAACAAC	55°C, 201 п.н. f+rl, С-аллель
	DCHS2_2714_rl	TGTGTGTAGAAGATAGTTCTGATCACTTTAAGATTGACGCCAACCG	55°C, 201 п.н. f+rl, С-аллель
	DCHS2_2714_fl	GGAAGGTCTATAATCATACGAAAGTATTGTGGTTGTTCTTATTTCA CCGT	55°C, 319п.н. fl+r, Т-аллель
	DCHS2_2714_r	GACTCGTGAAAGTTTATTATACCATTTTGTCCACTTTTTTGTATGC	55°C, 319п.н. fl+r, Т-аллель
	DCHS2_0437_f	TGCCACCCATCTCTCTATTTGTCCTTGCA	58,5°C, ЗИп.н. f+rl, Т-аллель
	DCHS2_0437_rl	GGGTAACAGAAAGAGACTTCATCTTTTTTTTTTTTTTTGGCAGCTAG ATA	58,5°C, ЗИп.н. f+rl, Т-аллель
	DCHS2_0437_fl	CTTCCCAAATGCTGTTTTTCCCTTCAGAGGCATCG	58,5°C, 164 п.н. fl+r, G-аллель
	DCHS2_0437_r	GAGGCCAAGGTGTGAGGATAGCTTGC	58,5°C, 164 п.н. fl+r, G-аллель
	DCHS2_5573_f	GGCTGGATGGAAGGGAAAATGGGAG	57°C, 280 п.н. f+rl, А-аллель
	DCHS2_5573_rl	AAGGAAGGAATGGAAAAGTAACATACAGCATCCTCGT	57°C, 280 п.н. f+rl, А-аллель
	DCHS2_5573_fl	GATGACTCATCTAGCATAAACGTCATGTTTTCATTTCCCG	57°C, 175 п.н. fl+r, G-аллель
	DCHS2_5573_r	ACCACAACCCCACTTTTATTTCTTTCCCCAATG	57°C, 175 п.н. fl+r, G-аллель
	DCHS2_1984_f	CAATAGAAAACATTGACTGGGTCTCTGCAAAACTAAAAAC	57°C, 145 п.н. f+rl, Т-аллель
	DCHS2_1984_rl	GGAACAGAACCCTTTTGATGTGTTTCTTTCCCCAA	57°C, 145 п.н. f+rl, Т-аллель
	DCHS2_1984_fl	ACAATGACAGTTGTCTGGTTTGTAGGCGACCC	57°C, 265 п.н. fl+r, С-аллель
	DCHS2_1984_r	TGACTGATGAGGCTTCTGGTGCATTCAC	57°C, 265 п.н. fl+r, С-аллель
	DCHS2_1014_f	AGAAGATGGGCTCATTGTCATTCACATCATCTACG	59°C, 167 п.н. f+rl, С-аллель
	DCHS2_1014_rl	TGATTCCGAAAGCGGTGCGATCAGCACTATCCGTG	59°C, 167 п.н. f+rl, С-аллель
	DCHS2_1014_fl	CTCCACCGCCTCCTGGACCTCTCGGTCTAGAAT	59°C, 302 п.н. fl+r, Т-аллель
	DCHS2_1014_r	CTGACCTCAATGACCAACCACCTCTCTTCAG	59°C, 302 п.н. fl+r, Т-аллель
3 n C4 и	PLAU_7564_f	TGAGGGGAGGAGGCAGGGAAGGC	64°C, 151 п.н. f+rl, С-аллель
	PLAU_7564_rl	AGTCATGCACCATGCACTCTTGGACAAGTG	64°C, 151 п.н. f+rl, С-аллель
	PLAU_7564_fl	CTGGTGCTATGTGCAGGTGGGCCTAAAGTT	64°C, 256 п.н. fl+r, Т-аллель
	PLAU_7564_r	AATTCTTCTGGAGGAGAGGAGGGCTTTTTTC	64°C, 256 п.н. fl+r, Т-аллель
§ s	PLAUR_4760_f	CACTGGCCTGAGGTCACACAGCAAGTCTGTAG	62,5°C, 187 п.н. f+rl, G-аллель
	PLAUR_4760_rl	CTCAGCCTGGCCCTGCCCATCTCAGCAC	62,5°C, 187 п.н. f+rl, G-аллель
	PLAUR_4760_fl	CAGTCTGGCAGTCATTAGCAGGGTGATGGTAA	62,5°C, 267 п.н. fl+r, А-аллель

ПримечIанние. Столбцы в таблице обозначены: 1 - ген и геномный вариант гена, 2 - праймер, 3 - последовательность 5’->3’, 4 - температура отжига праймера, длина ампликона, детектируемая аллель.

Для амплификации использовали ПЦР-смесь 5X ScreenMix-HS (UDG) (Евроген, #PK243L) согласно инструкциям производителя. Для визуализации выявленных геномных вариантов продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Визуализацию продуктов ПЦР проводили при помощи ChemiDoc™ MP Imaging System.

Специфичность амплифицированных продуктов подтверждалась секвенированием по Сэнгеру наиболее длинного ампликона, полученного с помощью внешних праймеров.

Статистическая обработка

Статистическую обработку и визуализацию данных проводили в программе SigmaPlot11.0 (Systat Software, Inc., Germany). В сравниваемых группах для каждого из геномных вариантов подсчитывали распределение идентифицированных аллелей (гомозиготы АА и ВВ, гетерозиготы АВ). Попарное сравнение частот встречаемости обнаруженных вариантов между основной группой и группой сравнения осуществляли с помощью точного теста Фишера для матриц 2X3 в расширении Фримена-Хэлтона [13]. Поскольку одновременно производили сравнение только двух групп, поправку Бонферрони не использовали. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Первая глава результатов (секвенирование)

Выполнено полноэкзомное секвенирование 11 образцов геномной ДНК пациентов, страдающих параноидной шизофренией, с последующим выравниванием на референсн 1 ый геном человека GRCh37.p13/hg19 [14]. Согласно результатам произведенного секвенирования было обнаружено 166 миссенс-мутаций в 70 генах, вовлеченных в развитие структуры нервной ткани и закладку основных элементов головного мозга ( BDNF, CDH2, CDH3, CDH4, CDH5, CDH7, CDH9, CDH11, CDH12, CDH15, CDH16, CDH17, CDH18, CDH19, CDH20, CDH23, CDH24, CDH26, CDH27, CDHR1, CDHR2, CDHR3, CDHR4, CD44, DCC, EFNA1, EFNA3, EFNA4, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA10, GFRA1, NGF, NRP1, NRP2, NTN3, NTN4, NTRK1, PCDHGA12, PLAUR, PLXNA2, PLXNA3, рPLXNA4, р PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, SSEMA3A, SPASEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, S. SEMA3G, S. SEMA4B, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SSEMA5A, S. SEMA5B, SEMA6A, SEMA6D, SEMA7A, UNC5C, VEGFC, VEGFD, VLDLR).

Известно, что идентифицированные замены могут приводить к изменению локального заряда или полярности белковой молекулы, что, в свою очередь, может изменять структурные и функциональные характеристики вовлеченного белка. В некоторых случаях было идентифицировано образование преждевременного стоп-кодона, а именно в генах CDH2 rs1944294-T (L21Stop) и NRP2 rs200483574-A (C960Stop) или сдвиг рамки считывания (SEMA3B - rs67324803).

Вторая глава результатов (ПЦР-скрининг)

С целью мониторинговой оценки распространенности отдельных геномных вариантов на больших по объему двух исследовательских выборках (102 пациента с параноидной шизофренией и 103 психически здоровых доноров) было отобрано 16 миссенс-мутаций, в частности такие как BDNF rs6265, CDH2 rs17445840 и rs1944294, CDH3 rs12923655 и rs3114409, CDH13 rs4782724, CDH23 rs10999947 и rs1227051, CDH19/DCHS1 rs4758443, CDH27/DCHS2 rs1352714, rs12500437, rs11935573, rs28561984 и rs72731014, PLAU rs2227564, PLAUR rs4760.

Критериями отбора геномных вариантов для проведения генетического скрининга служили: 1) уровень вовлеченности гена в развитие ЦНС, включая литературные данные о его роли в развитии психических, когнитивных и неврологических нарушений, 2) аминокислотная замена на стоп-кодон или аминокислоту с противоположным зарядом или полярностью, 3) распространенность конкретного геномного варианта среди изученных экзомов.

Скрининговый анализ выбранных геномных вариантов позволил установить статистически значимые различия между их распространенностью в группе пациентов с параноидной шизофренией и в группе психически здоровых доноров. Так, в группе пациентов с шизофренией была обнаружена статистически значимая более высокая частота встречаемости геномных вариантов rs1944294-T гена CDH2 (p=0,0443, n=102), rs11935573-G (p=0,0009, n=102) и rs12500437-G гена DCHS2 (p=0,034, n=102) по сравнению с группой психически здоровых доноров.

В то же время частота встречаемости однонуклеотидного геномного варианта гена BDNF rs6265-T (V66M), ранее описанного в литературе как ассоциированный с манифестацией параноидной шизофрении в китайской популяции [15], статистически значимо не отличалась в сравниваемых группах пациентов с параноидной шизофренией и психически здоровых доноров (p=0,0641, n=102). Частоты встречаемости идентифицированных геномн [ ых вариантов приведены в таблице 2.

Ввиду того, что те или иные геномн[ые варианты могут быть сцеплены с признаком пола и в большей степени проявляться при определенном сочетании генов и в определенн[ых условиях, нами было проведено разделение группы пациентов с параноидной шизофренией и группы психически здоровых доноров по полу.

Таблица 2. Частоты встречаемости некоторых геномных вариантов в генах морфогенеза головного мозга, идентифицированных у пациентов с параноидной шизофренией и психически здоровых доноров

1	2	3	4	5	P	6			P
BDNF rs6265 (C—T, V66M)	2	c/c	C/T	T/Т	P	C	T		P
	ГС (11=103)	64	29	1	0.0641	157	31	0,196	0.658
	or (11= 102)	77	19	5	0.0641	173	29	0,196	0.658
CPH2 rs! 944294 (A-+T, L21 Stop)	ГС (n=103)	A/A	A/T	T/T		A	T
	ГС (n=103)	71	29	0	0.0443	171	29	2,32	0.128
	or (n=!02)	65	30	6	0.0443	160	42	2,32	0.128
CDH2 rs!7445S40 (C—T. Al 1ST)	ГС(п=103)	C/C	C/T	T/T		c	T
	ГС(п=103)	94	7	0	0,4599	195	7	0.493	0.483
	ОГ (n=!02)	91	11	0	0,4599	193	11	0.493	0.483
CDH3 rs 12923655 (A-C. T808P)	ГС (n=103)	A/A	A/C	c/c		A	C
	ГС (n=103)	37	41	22	0,8340	115	85	0,661	0.416
	ОГ (n= 102)	33	41	27	0,8340	107	95	0,661	0.416
CDH3 rs3114409 (A^C, R778S)	ГС (n=103)	A/A	A/C	C/C		A	C
	ГС (n=103)	54	37	8	0,7900	145	53	0,293	0.589
	ОГ (n=102)	50	42	9	0,7900	142	60	0,293	0.589
CDH13 rs4782724 (C^T, P55S)	ГС (11=103)	C/C	C/T	T/T		C	T
	ГС (11=103)	2	9	92	0,7770	13	193	0,402	0.526
	ОГ(n=102)	1	7	94	0,7770	9	195	0,402	0.526
CDH23 rs!227051 (G^A. A1575T)	ГС (11=103)	G/G	G/A	A/A		G	A
	ГС (11=103)	9	20	72	0,1232	38	164	1.465	0.226
	ОГ (n= 102)	8	33	60	0,1232	49	153	1.465	0.226
CDH23 rs i 0999947 (G^A. S496N)	ГС (11=103)	G/G	G/A	A/A		G	A
	ГС (11=103)	51	42	7	0,2658	144	56	0.00954	0.922
	ОГ (n=!02)	57	33	12	0,2658	147	57	0.00954	0.922
DCHS1 rs4758+43 (G^A. T1949M)	ГС (11=103)	G/G	G/A	A/A		G	A
	ГС (11=103)	32	54	16	0,1037	118	86	3.785	0,052
	ОГ (n= 102)	46	46	10	0,1037	138	66	3.785	0,052
DCHS2 rs 12500437 (G^T. P1342 H)	ГС (11=103)	G/G	G/T	T/T		G	T
	ГС (11=103)	1	9	90	0.1131	1 i	189	4.509	0,034
	ОГ (n=!02)	4	16	80	0.1131	24	176	4.509	0,034
DCHS2 rs72731014 (T^C, T620A)	ГС (n=103)	T/T	T/C	C/C		T	C
	ГС (n=103)	58	35	6	0.5552	151	47	1,035	0.309
	ОГ (n=IO2)	53	38	10	0.5552	144	58	1,035	0.309
DCHS2 rs28561984 (C^T,E2O5OK)	ГС (n=103)	C/C	C/T	T/T		C	T
	ГС (n=103)	70	28	5	0.6886	168	38	0,297	0.586
	ОГ (n=102)	64	33	5	0.6886	161	43	0,297	0.586
DCHS2 rs 1352714 (T->C.Ni352S)	ГС (11=103)	T/T	T/C	c/c		T	C
	ГС (11=103)	2	3	95	0.2897	7	193	0.416	0,519
	ОГ (n=i02)	2	0	100	0.2897	4	200	0.416	0,519
DCHS2 rs 11935573 (G^A,S1660L)	ГС (11=103)	G/G	G/A	A/A		G	A
	ГС (11=103)	19	69	11	0,0009	107	91	6.856	0,009
	ОГ (11=102)	44	48	9	0,0009	136	66	6.856	0,009
PLAU rs2227564 (T^C.L141P)	ГС (n=103)	T/T	T/C	C/C		T	C
	ГС (n=103)	8	40	51	0,3177	56	142	1,92	0.166
	ОГ (n=102)	4	36	61	0,3177	44	158	1,92	0.166
PLA UR rs4760 (A^G, L224P)	ГС (n=103)	A/A	A/G	G/G		A	G
PLA UR rs4760 (A^G, L224P)	ГС (n=103)	66	34	I	0,1720	166	36	1,996	0.158

ПримечIанвие. Столбцы в таблице обозначены: 1 - ген и полиморфный вариант гена, 2 - группа обследованных: ГС - группа сравнения (психически здоровые доноры), ОГ - основная группа (пациенты с параноидной шизофренией), 3 - Вар1 (вариант 1), 4 - Вар1/Вар2 (комбинация вариантов 1 и 2), 5 - Вар2 (вариант 2), 6 - частота встречаемости аллели.

Анализ изолированных женской (47 образцов) и мужской (55 образцов) выборок с параноидной шизофренией продемонстрировал, что у женщин наблюдается статистически значимая более высокая частота встречаемости вариантов rs6265-T (V66M) гена BDNF (p=0,0180, n=47) и rs1944294-T (L21Stop) гена CDH2 (p=0,0495, n=47) со снижением частотности носительства соответствующих гетерозиготных вариантов в группе психически здоровых доноров. Помимо этого, было показано, что гетерозиготный вариант rs1227051-G/A гена CDH23 чаще встречается у женщин с параноидной шизофренией (p=0,0190, n=47) и сопровождается снижением частоты встречаемости гомозиготного варианта rs1227051-A по сравнению с группой психически здоровых доноров. В выборке мужчин с параноидной шизофренией была зарегистрирована более высокая частота встречаемости геномных вариантов rs11935573-G (S1660L) гена DCHS2 (p=0,00002, n>32) и G-аллели rs4760 (L224P) гена PLA UR (p=0,035, n>32).

Таким образом, скрининговое исследование выявило статистически значимые различия между частотой встречаемости миссенс-мутаций в генах морфогенеза головного мозга в зависимости от половой принадлежности обследованных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Современн 1 ые представления о патогенезе психических и поведенческих расстройств предполагают дисбаланс активирующих и тормозных систем в головном мозге, одной из причин которого может быть нарушение закладки и морфогенеза нервной ткани. В свою очередь нарушение развития и созревания головного мозга может быть обусловлено нарушением функционирования вовлеченных в данные процессы генов. При бесспорной актуальности данной тематики, по нашим данным, полномасштабных систематических исследований в этой области не проводилось, в частности на российской популяции.

Нами было проведено полноэкзомное секвенирование геномной ДНК 11 пациентов, страдающих параноидной шизофренией. Идентифицировано 166 миссенс-мутаций в 70 генах, вовлеченных в развитие нервной ткани и закладку головного мозга. Большинство идентифицированных миссенс-мутаций приводят к изменению полярности или заряда закодированной аминокислоты и соответствующего фрагмента белковой молекулы, что может влиять на уровен 1 ь экспрессии, растворимость, компартментализацию и активность измененного белка. Идентифицированные миссенс-полиморфизмы были известны и ранее, однако для абсолютного большинства из них (за исключением rs6265 гена BDNF) [15] не было показано участие в формировании предрасположенности к развитию психических и пове- денческих расстройств (ни в виде ассоциаций, ни в виде функциональных исследований).

Собственное скрининговое исследование в группе пациентов, страдающих параноидной шизофренией, позволило выявить несколько геномн 1 ых вариантов в генах морфогенеза, частота встречаемости которых статистически значимо отличалась от таковой в группе психически здоровых доноров. Многие из идентифицированн 1 ых геномных вариантов установлены впервые. Так, в группе пациентов с параноидной шизофренией была обнаружена статистически значимая (p<0,05) более высокая частота встречаемости геномных вариантов rs1944294-T гена CDH2 и rs11935573-G гена DCHS2 по сравнению с группой психически здоровых доноров.

Обнаруженные миссенс-м 1 утации приводят к образованию преждевременного стоп-кодона (rs1944294-T, L21Stop) в одной из изоформ CDH2 или к изменению полярности части внеклеточного домена молекулы DCHS2 (rs11935573-G, S1660L), что, как предполагается, может быть предрасполагающим фактором развития психических и когнитивных нарушений. Полученные нами результаты подкрепляются данными литературы, согласно которым CDH2 (N-кадгерин) является одной из ключевых молекул для перехода постмитотических нейронов от мультиполярного к биполярному типу миграции и последующей их радиальной миграции [16], а мутации гена CDH2 могут предрасполагать к развитию синдрома дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ). Ген CDH27/DCHS2, согласно данным литературы, ответственен за формирование структуры лица, а мутации в нем ассоциирован 1 ы с развитием так называемого це-реброфациоартикулярного синдрома [17], характеризующегося нарушением развития лица, суставов, дистопией серого вещества головного мозга и задержкой нервно-психического развития различной степени тяжести.

Разделение общей выборки в группе пациентов с параноидной шизофренией по полу позволило выявить и другие генетические варианты, ассоциированные с развитием шизофрении в российской популяции. Так, только в женской выборке пациентов с параноидной шизофренией была зарегистрирована статистически значимая (p<0,05) более высокая частота встречаемости варианта rs6265-T (V66M) гена BDNF и статистически значимая (p<0,05) меньшая частота встречаемости варианта rs1227051-A гена CDH23. В мужской выборке пациентов с параноидной шизофренией отмечается статистически значимая более высокая частота встречаемости геномного варианта rs11935573-G (S1660L) гена DCHS2 (p=0,00002, n>32) и G-аллели rs4760 (L224P) гена PLA UR (p=0,035, n>32).

Полученные результаты оказались вполне ожидаемы, поскольку ген 1 ы BDNF и PLA UR принимают участие в процессах пролиферации, выживании и миграции нейральных прогениторных клеток, в установлении и стабилизации межнейрональных связей, а деструктивное изменение их функционирования может быть ассоциировано с развитием неврологических нарушений и когнитивных дефицитов. Так, было показано, что вариант rs6265-T (V66M) гена BDNF снижает индуцируемую продукцию BDNF [18] и ассоциирован с повышенным риском параноидной шизофрении в китайской популяции [15]. Нарушения экспрессии PLA UR, предположительно, являются одной из причин развития расстройств аутистического спектра [19], что подтверждается материалами экспериментального исследования на животных [20]. Однако все описанные до этого SNP гена PLAUR, ассоциированные с развитием психических и поведенческих расстройств, локализовались в некодирующих участках гена PLAUR [19, 21]. Для гена CDH23 ранее была представлена ассоциация с синдромом врожденной слепо-глухоты (синдром Ашера) и генетической предрасположенностью к риску развития шизофрении [22].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые на материале российской популяции был идентифицирован ряд геномных миссенс-вариантов в генах морфогенеза головного мозга, ассоциированных с частотой встречаемости параноидной шизофрении. Для установления механизмов влияния выявленных геномных вариантов на процессы развития и функционирования головного мозга, а также определения их вклада в патогенез психических и когнитивных нарушений требуется проведение дополнительных исследований на клеточных и животных моделях с привлечением генетических технологий [23, 24], что и будет осуществлено как самостоятельный фрагмент продолжения данного исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование проведено при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-15-00125,

СООТВЕТСТВИЕ ПРИНЦИПАМ ЭТИКИ

Исследование соответствует нормам этики современных этических стандартов, разработанных в соответствии с Хельсинкской декларацией ВМА, и одобрено Межвузовским комитетом по этике (протокол № 11 от 16.12.2021).

Список литературы Идентификация геномных вариантов в генах морфогенеза нервной ткани, ассоциированных с развитием параноидной шизофрении (на материале российской популяции)

Доклад о психическом здоровье в мире. Охрана психического здоровья: преобразования в интересах всех людей. ВОЗ, 2022. 28 с.
Trubetskoy V, Pardiñas AF, Qi T et al. Mapping genomic loci implicates genes and synaptic biology in schizophrenia. Nature. 2022 Apr;604(7906):502-508. doi: 10.1038/s41586-022-04434-5. Epub 2022 Apr 8. PMID: 35396580; PMCID: PMC9392466.
Meyerink BL, Tiwari NK, Pilaz LJ. Ariadne's thread in the developing cerebral cortex: mechanisms enabling the guiding role of the radial glia basal process during neuron migration. Cells. 2020 Dec 22;10(1):3. doi: 10.3390/cells10010003. PMID: 33375033; PMCID: PMC7822038.
Jiang X, Nardelli J. Cellular and molecular introduction to brain development. Neurobiol Dis. 2016 Aug;92(Pt A):3-17. doi: 10.1016/j.nbd.2015. 07.007. Epub 2015 Jul 13. PMID: 26184894; PMCID: PMC4720585.
Stiles J, Jernigan TL. The basics of brain development. Neuropsychol Rev. 2010 Dec;20(4):327-48. doi: 10.1007/s11065-010-9148-4. Epub 2010 Nov 3. PMID: 21042938; PMCID: PMC2989000.
Gareeva AE, Traks T, Koks S, Khusnutdinova EK. The role of neurotrophins and neurexins genes in the risk of paranoid schizophrenia in Russians and Tatars. Genetika. 2015 Jul;51(7):799-811. Russian. PMID: 26410934.
Клинические рекомендации. Шизофрения. Разработчик: Российское общество психиатров. М.: МннздравРоссии, 2019. [Электронныйресурс].
Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60. doi: 10.1093/bioinformatics/btp324. Epub 2009 May 18. PMID: 19451168; PMCID: PMC2705234.
McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, Kernytsky A, Garimella K, Altshuler D, Gabriel S, Daly M, DePristo MA. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010 Sep;20(9):1297-303. doi: 10.1101/gr.107524.110. Epub 2010 Jul 19. PMID: 20644199; PMCID: PMC2928508.
Tylee DS, Sun J, Hess JL, Tahir MA, Sharma E, Malik R, Worrall BB, Levine AJ, Martinson JJ, Nejentsev S, Speed D, Fischer A, Mick E, Walker BR, Crawford A, Grant SFA, Polychronakos C, Bradfield JP, Sleiman PMA, Hakonarson H, Ellinghaus E, Elder JT, Tsoi LC, Trembath RC, Barker JN, Franke A, Dehghan A; 23 and Me Research Team; Inflammation Working Group of the CHARGE Consortium; METASTROKE Consortium of the International Stroke Genetics Consortium; Netherlands Twin Registry; neuroCHARGE Working Group; Obsessive Compulsive and Tourette Syndrome Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium; Faraone SV, Glatt SJ. Genetic correlations among psychiatric and immune-related phenotypes based on genome-wide association data. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2018 Oct;177(7):641-657. doi: 10.1002/ajmg.b.32652. Epub 2018 Oct 16. PMID: 30325587; PMCID: PMC6230304.
Yin H, Pantazatos SP, Galfalvy H, Huang YY, Rosoklija GB, Dwork AJ, Burke A, Arango V, Oquendo MA, Mann JJ. A pilot integrative genomics study of GABA and glutamate neurotransmitter systems in suicide, suicidal behavior, and major depressive disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2016 Apr;171B(3):414-426. doi: 10.1002/ajmg.b.32423. Epub 2016 Feb 19. PMID: 26892569; PMCID: PMC4851346.
Chen J, Xu X, Dalhaimer P, Zhao L. Tetra-primer amplification-refractory mutation system (ARMS)-PCR for genotyping mouse leptin gene mutation. Animals (Basel). 2022 Oct 5;12(19):2680. doi: 10.3390/ani12192680. PMID: 36230421; PMCID: PMC9558987.
Расширение попарного сравнения вероятностного теста Фишера [Электронный ресурс].
Референсная ДНК-последовательность генома человека [Электронный ресурс]. URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_000001405.25
Li W, Zhou N, Yu Q, Li X, Yu Y, Sun S, Kou C, Chen DC, Xiu MH, Kosten TR, Zhang XY. Association of BDNF gene polymorphisms with schizophrenia and clinical symptoms in a Chinese population. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2013 Sep;162B(6):538-45. doi: 10.1002/ajmg.b.32183. Epub 2013 Jul 7. PMID: 23832605.
Meyerink BL, Tiwari NK, Pilaz LJ. Ariadne's thread in the developing cerebral cortex: mechanisms enabling the guiding role of the radial glia basal process during neuron migration. Cells. 2020 Dec 22;10(1):3. doi: 10.3390/cells10010003. PMID: 33375033; PMCID: PMC7822038.
Ivanovski I, Akbaroghli S, Pollazzon M, Gelmini C, Caraffi SG, Mansouri M, Chavoshzadeh Z, Rosato S, Polizzi V, Gargano G, Alders M, Garavelli L, Hennekam RC. Van Maldergem syndrome and Hennekam syndrome: Further delineation of allelic phenotypes. Am J Med Genet A. 2018 May;176(5):1166-1174. doi: 10.1002/ajmg.a.38652. PMID: 29681106.
Chen ZY, Patel PD, Sant G, Meng CX, Teng KK, Hempstead BL, Lee FS. Variant brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Met66) alters the intracellular trafficking and activity-dependent secretion of wild-type BDNF in neurosecretory cells and cortical neurons. J Neurosci. 2004 May 5;24(18):4401-11. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0348-04.2004. PMID: 15128854; PMCID: PMC6729450.
Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н., Примак А.Л., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Роль урокиназы, Т-кадгерина и адипонектина в развитии шизофрении, биполярного расстройства и болезни Альцгеймера (обзор литературы). Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии. 2022. № 12. С. 925-937. doi:10.33920/med-01-2212-01.
Shmakova AA, Balatskiy AV, Kulebyakina MA, Schaub T, Karagyaur MN, Kulebyakin KY, Rysenkova KD, Tarabykin VS, Tkachuk VA, Semina EV. Urokinase receptor uPAR overexpression in mouse brain stimulates the migration of neurons into the cortex during embryogenesis. Russ. J. Dev. Biol. 2021; 52: 53-63. doi:10.1134/S1062360421010069.
Шмакова А.А., Семина Е.В., Нейфельд Е.А., Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н. Анализ связи генетических факторов с риском развития шизофрении. Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2023. Т. 123, № 2. С. 26.36. doi:10.17116/jnevro202312302126.
Balan S, Ohnishi T, Watanabe A, Ohba H, Iwayama Y, Toyoshima M, Hara T, Hisano Y, Miyasaka Y, Toyota T, Shimamoto-Mitsuyama C, Maekawa M, Numata S, Ohmori T, Shimogori T, Kikkawa Y, Hayashi T, Yoshikawa T. Role of an atypical cadherin gene, cdh23 in prepulse inhibition, and implication of cdh23 in schizophrenia. Schizophr Bull. 2021 Jul 8;47(4):1190-1200. doi: 10.1093/schbul/sbab007. PMID: 33595068; PMCID: PMC8266601.
Białoń M, Wąsik A. Advantages and Limitations of Animal Schizophrenia Models. Int J Mol Sci. 2022 May 25;23(11):5968. doi: 10.3390/ijms23115968. PMID: 35682647; PMCID: PMC9181262.
Karagyaur M, Primak A, Efimenko A, Skryabina M, Tkachuk V. The power of gene technologies: 1001 ways to create a cell model. Cells. 2022 Oct 14;11(20):3235. doi: 10.3390/cells11203235. PMID: 36291103; PMCID: PMC9599997.

Еще