Идентификация культивируемых органотрофных бактерий прибрежно-соровой зоны озера Байкал

Олиготрофное озеро Байкал — одно из величайших пресных озер мира, характеризующееся разнообразием биотопов. Прибрежно-соровая зона озера Байкал включает мелководные заливы озера Байкал (соры). Мелководье соров отличается хорошей прогреваемостью в летний период и высокой продуктивностью (Кулагин, Помазкина, 1977). Одним из существенных компонентов биоты озер являются микроорганизмы, играющие важную роль в круговороте веществ и энергии. Деятельность микроорганизмов обеспечивает высокое качество байкальской воды, главным образом отвечая за процесс деструкции органического вещества, осуществляемый органотрофными бактериями. В водной экосистеме прибрежно-соровой зоны органотрофные бактерии являются важным компонентом круговорота органических веществ, участвуя в процессах деструкции и минерализации органических соединений Органотрофные культивируемые бактерии озера Байкал изучались ранее — было определено видовое разнообразие и описаны факторы, влияющие на состав сообщества (Парфенова и др., 2006; Белых и др., 2013; Галачьянц и др., 2016). Органотрофные бактерии прибрежно-соровой зоны озера Байкал не изучались.

Объекты и методы. Пробы были отобраны в прибрежно-соровой зоне озера Байкал — мелководных заливах Провал, Посольский Сор и Истоминский Сор, а также участках открытого Байкала Боярск и Энхалук, расположенных вблизи заливов. Мелководные заливы Провал, Посольский Сор и Сор Черкалов находятся в придельтовом пространстве крупнейшего притока озера Байкал — реки Селенга. Отбор проб воды проводили с помощью батометра и переливали в стерильную посуду. Из воды изолировали в чистую культуру численно доминировавшие при посеве на твердую питательную среду РПА:10 (рыбо-пептонный агар, разведенный в 10 раз) колонии. Посевы культивировали аэробно в течение 2 суток при комнатной температуре. Для идентификации было отобрано 8 чистых культур органотрофных бактерий. Чистоту культур контролировали визуально и микроскопически. Морфологию бактерий изучали с помощью живых и окрашенных препаратов на микроскопе Axiostar Plus («ZEISS», Германия). Способность культур использовать ряд углеводов, спиртов и других органических соединений определяли на среде Пфеннига с добавлением 0,5-1% субстрата.

Для выделения ДНК биомассу, полученную из колонии культуры, суспендировали в безбактериальной воде и проводили выделение ДНК методом ферментативного лизиса (Белькова, Андреева, 2009). Секвенирование было произведено в ЦКП «Геномика» (Новосибирск). После секвенирования последовательности проверяли и корректировали с помощью программы Bioedit, поиск химерных структур вели с помощью пакета программ Pintail, сравнительный анализ — с помощью пакета программ FASTA . Для выравнивания набора последовательностей использовали программу ClustalW, далее выровненные последовательности использовали для построения филогенетического древа в программе MEGA ver.5.01.

Результаты и обсуждение. Морфологическое описание колоний и клеток культур представлено в табл. 1. Культуры были преимущественно представлены грамположительными палочками и кокками. Грамотрицательные бактерии были представлены палочками: короткими или длинными тонкими.

Таблица 1

Морфологическое описание выделенных чистых культур органотрофных бактерий

№	Название культуры	Описание колоний на твердой среде	d, мм	Форма клеток, размеры, окраска по Граму
1	LBPr5	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль кратерообразный	3	Палочки 1,17х0,50мкм, Гр-
2	LBPr6	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль каплевидный	2	Палочки 1,53х0,45мкм, Гр+

3	LBPr24	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль кратерообразный	4	Палочки 1,44х0,69мкм, Гр+
4	LBPr25	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль кратерообразный	4	Палочки 2,10х0,80мкм, Гр+
5	LBPS2	Бесцветная, форма округлая, поверхность гладкая, профиль плоский, с фестончатым краем	5	Палочки 0,80х0,88мкм, Гр-
6	LBIst	Оранжевая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль конусовидный, с фестончатым краем	4	Палочки 0,89х0,45мкм, Гр+
7	LBB2	Желтая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль кратерообразный	4	Кокки 0,71мкм, Гр+
8	LBChiv 2	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, профиль каплевидный	2	Палочки 1,69х0,54мкм, Гр+

Была проведена идентификация культур по анализу гена 16S рРНК. Полученные нуклеотидные последовательности зарегистрированы в международном банке данных, проведен их сравнительный (табл. 2) и филогенетический анализ (рис. 1).

Таблица 2

Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей чистых культур органотрофных бактерий

№ (п.н.)	Номер в банке данных	Ближайший родственник, гомология	Филум/класс, семейство
LBPr5 (886)	HE617668	Pseudomonas  fluorescens, 95%	Gammaproteobacteria, Pseudomonadaceae
LBPr6 (1443)	HE617669	Brevibacterium casei , 99%	Actinobacteria, Brevibacteriaceae
LBPr24 (1090)	HE617663	Brevibacterium sp., 97%	Actinobacteria, Brevibacteriaceae
LBPr25 (1447)	HE617664	Brevibacterium sp., 99%	Actinobacteria, Brevibacteriaceae
LBPS2 (1451)	HE617670	Pseudomonas  fluorescens , 98%	Gammaproteobacteria, Pseudomonadaceae
LBIst (1434)	HE617667	Aeromicrobium sp., 96%	Actinobacteria, Nocardioidaceae
LBB2 (1423)	HE617665	Agrococcus sp., 99%	Actinobacteria, Microbacteriaceae
LBChiv 2 (1441)	HE617666	Brevibacterium sp., 99%	Actinobacteria, Brevibacteriaceae

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с ближайшими гомологами показал, что они являются представителями классов Actinobacteria и Gammaproteobacteria, относящимся к широко распространенным группам. Следует отметить, что представители этих классов доминируют в некультивируемом микробном сообществе озера Байкал по данным пиросеквенирования (Разнообразие …, 2016). Исследуемые штаммы могут быть отнесены к родам Brevibacterium (4 штамма), Pseudomonas (2 штамма), Aeromicrobium (1 штамм) и Agrococcus (1 штамм).

Грамотрицательные штаммы LBPr5 и LBPS2 имеют среди ближайших родственников представителей вида Pseudomonas fluorescens . Следует отметить, что в настоящее время невозможно провести идентификацию псевдомонад только по фрагменту гена малой субъединицы РНК, для корректного анализа необходимо использовать дополнительно либо фрагмент 23S рРНК, либо межгенный спейсер, поэтому эти штаммы корректно отнести к роду Pseudomonas sp. Высокий процент гомологии с ближайшими родственниками актинобактерий и филогенетический анализ с типовыми штаммами соответствующих родов позволяет идентифицировать штаммы LBPr24, LBPr25, LBChiv2, LBPr6 как Brevibacterium casei.

Штамм LBB2 на основании филогенетического анализа попадает в один кластер с видами Agrococcus jenensis DSM 9580Т (X92492) и Agrococcus citreus IAM 15145Т (AB279547).

Однако высокий процент гомологии только с последовательностями неиден-тифицированных штаммов, невысокая бутстреп поддержка кластеризации и наличие только двух зарегистрированных последовательностей этих видов не позволяют идентифицировать этот штамм до вида. Другой штамм LBIst кластеризуется с видами Aeromicrobium flavum TYLN1Т (EF133690) и Aeromicrobium tamlense SSW1-57Т (DQ411541). Однако, несмотря на невысокий процент гомологии с последовательностями ближайших родственников, филогенетический анализ выявил достаточно высокий уровень бутстреп поддержки кластеризации с типовым штаммом Aeromicrobium flavum TYLN1Т (EF133690), поэтому этот штамм может быть отнесен к виду Aeromicrobium flavum.

Чистые культуры LBPr6 (Brevibacterium casei, 99%), LBPr25 (Brevibacterium sp., 99%) были проверены на способность к росту на различных органических субстратах.

Было установлено, что культуры обладали способностью использовать широкий спектр субстратов (табл. 2). Культура LBPr6 Brevibacterium casei активно потребляла дульцит, пируват, лактат, а также пептон и триптон. Наименьший рост наблюдался на субстратах галактоза и лактоза и в группе спиртов на манните и сорбите. Отмечено интенсивное потребление карбоновых кислот культурой LBPr25 Brevibacterium sp.; также хороший рост отмечен на пептоне, триптоне и дрожжевом экстракте, входящих в состав сред при культивировании бактерий. Слабый рост у изученных культур замечен на сорбите и желатине.

Таким образом, из воды прибрежно-соровой зоны озера Байкал было выделено 8 чистых культур органотрофных бактерий, относящихся к представителям широко распространенных родов Brevibacterium, Pseudomonas , Aeromicrobium и Agrococcus. Сравнивая с разнообразием культивируемых органотрофных бактерий в глубоководной зоне (Парфенова), литоральной зоне (Белых) и нейстоне (Галачьянц) озера Байкал, можно отметить, что представители рода Pseudomonas

0.01

Brevibacterium casei FM1A (AY468365)

Brevibacterium casei LBPr6 (HE617669)

Brevibacterium casei 3299BRRJ (FJ200388)

Brevibacterium casei 60 (EU086802)

Brevibacterium sp . SA312 LBPr25 (HE617664)

Brevibacterium casei 379 (EU086799)

Brevibacterium sp . 2 LBPr24 (HE617663)

Brevibacterium casei yb154 (EU652099)

Brevibacterium casei B1(JF951998)

Brevibacterium sp . 2 LBChiv2 (HE617666)

Brevibacterium casei TSWCW1 (GQ284451)

Brevibacterium casei 3Tg (AY468375)

Brevibacterium casei JG 08 (EU937752)

Brevibacterium casei 3s (a) (AY468374)

{

Brevibacterium casei SRKP2 (GQ221248)

Brevibacterium casei SV2 (GU143785)

Brevibacterium casei (NCDO 2048) (X76564)

Brevibacterium casei DSM 20657^Т (AJ251418)

Brevibacterium casei PCSB (HM012705)

Г Brevibacterium celere KMM 3637^Т (AY228463)

Brevibacterium sanguinis CF63T^Т (AJ564859)

Brevibacterium antiquum VKM Ac-2118^Т (AY243344)

Brevibacterium aurantiacum NCDO 739^Т (X76566)

Brevibacterium linens 1MF (DQ361016)

Brevibacterium avium NCFB 3055^Т (Y17962)

Brevibacterium oceani BBH7T^Т (AM158906)

I— Brevibacterium linens DSM 20425^Т (X77451)

Brevibacterium epidermidis NCDO 2286^Т (X76565)

Brevibacterium permense VKM Ac-2280^Т (AY243343)

Brevibacterium iodinum DSM 2062^Т (X83813)

Brevibacterium marinum HFW-26T^Т (AM421807)

Brevibacterium picturae LMG 22061^Т (AJ620364)

Brevibacterium sandarakinum 01-Je-003^Т (FN293377)

Brevibacterium lutescens CF87T^Т (AJ488509)

Brevibacterium otitidis CIP105044^Т (AF133534)

99J Brevibacterium massiliense 5401308^Т (EU868814)

Brevibacterium ravenspurgense 20^Т (EU086793)

I- Brevibacterium mcbrellneri ATCC 49030^Т (X93594)

⁹⁹ Brevibacterium paucivorans CF 62^Т (AJ251463)

Brevibacterium samyangense SST-8^Т (DQ344485)

Brevibacterium pityocampae Tp12^Т (EU484189)

---------г Brevibacterium album YIM 90718^Т (EF158852)

99 Brevibacterium salitolerans TRM 415^Т (GU117109)

Agrococcus casei LMG 22410^Т (DQ168427)

98 Agrococcus jejuensis SSW1-48^Т (AM396260)

Agrococcus versicolor DSM 19812^Т (AM940157)

Agrococcus terreus DNG5^Т (FJ423764)

Agrococcus lahaulensis K22-21^Т (DQ156908)

Agrococcus baldri IAM 15147^Т (AB279548)

Agrococcus carbonis G4^Т (GQ504748)

Agrococcus jenensis DSM 9580^Т (X92492)

Agrococcus citreus IAM 15145^Т (AB279547)

Agrococcus sp . LBB2 (HE617665)

Aeromicrobioides flavum TYLN1^Т (EF133690)

95 г— Aeromicrobium sp . DR8 LBIst (HE617667)

Aeromicrobium tamlense SSW1-57^Т (DQ411541)

Aeromicrobium ponti HSW-1^Т (AM778683)

Aeromicrobium erythreum NRRL B-3381^Т (AF005021)

Aeromicrobium halocynthiae KME 001^Т (FJ042789)

Aeromicrobium panaciterrae Gsoil 161^Т (AB245387)

Aeromicrobium alkaliterrae KSL-107^Т (AY822044)

Aeromicrobium fastidiosum KCTC 9576^Т (AF005022)

85      Aeromicrobium ginsengisoli Gsoil 098^Т (AB245394)

⁸³      Aeromicrobium marinum DSM 15272^Т (AY166703)

Рис. 1. Положение чистых культур органотрофных бактерий LBPr24, LBPr25, LBB2, LBChiv2, LBIst, LBPr6 на филогенетическом древе. Для построения филогенетических взаимоотношений использованы полноразмерные последовательности гена 16S рибосомной РНК зарегистрированных в EMBL банке данных как типовые штаммы родов Aeromicrobium, Agrococcus и Brevibacterium . Древо построено методом объединения ближайших соседей, бутстреп анализ проведен для 1000 реплик. Масштаб соответствует 1 замене на 100 п. н.

были выделены из всех биотопов озера Байкал, виды рода Brevibacterium были выделены только из прибрежно-соровой зоны. Бревибактерии являются корине-формными бактериями, обычными представителями микрофлоры воды и почвы, способными к деструкции различных органических соединений, в том числе и трудноокисляемых. Две выделенные культуры рода Brevibacterium были способны использовать широкий спектр органических субстратов.

Работа выполнена в рамках реализации базового проекта ФАНО «Микробные сообщества экстремальных природных систем: биологическое и функциональное разнообразие, биотехнологический потенциал» № АААА-А17-117011810034-9 и при поддержке гранта РФФИ № 18-44-030028.