Идентификация метил-трет-бутилового эфира в крови человека хромато-масс-спектрометрическим методом

бутилового эфира (МТБЭ) в крови методом библиотечного поиска и сравнения по стандартному соединению.

Материалы и методы. Исследования выполнялись специалистами химико-аналитического отдела ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения». Объектами исследований являлись биологическая среда (кровь), стандартные растворы метил-трет-бутилового эфира, масс-хроматограммы, масс-спектры метил-трет-бутилового эфира.

Идентификация выполнена при использовании системы «газовая хроматография – масс-спектрометрия» (ГХ-МС). Хроматографическое разделение проводили на газовом хроматографе Agilent 7890А с использованием масс-селективного детектора 5975С и капиллярной колонки HP-5MS 30 m∙0,250 mm∙0,25 µm. Ионизацию газовых молекул МТБЭ осуществляли методом электронного удара [2]. Поиск характеристических ионов метил-трет-бути-лового эфира выполняли с помощью банка библиотеки масс-спектральных данных NIST 08.L.

Результаты и их обсуждение. Идентификацию осуществляли сравнением масс-спектра анализируемого соединения с масс-спектром стандартного образца МТБЭ с помощью соответствующих баз данных и компьютерного библиотечного поиска NIST.08L. Результаты идентификации стандартного образца МТБЭ по масс- спектрам позволили установить: химический состав; основные и подтверждающие ионы МТБЭ; время удерживания МТБЭ ; химическую структуру МТБЭ. Хроматограмма по полному ионному току стандартного образца МТБЭ представлена на рис. 1.

Оценка подобия справочной и исследуемой спектрограмм показала идентичность масс-спектра стандарта МТБЭ (верхняя часть рис. 2) и его библиотечного спектра (нижняя часть рис. 2).

Для изучаемого компонента определяли интегральные молекулярные признаки, к которым относятся молекулярная масса, суммарный элементный состав, химическая структурная формула и масс-спектры.

Для определения молекулярной массы и элементного состава исследуемого соединения методом масс-спектрометрии устанавливали пик молекулярного иона и измеряли отношение массы к заряду. По результатам библиотечного поиска установлен элементный состав метил-трет-бутилового эфира (2-метил-2-метоксипропан), отвечающий формуле C 5 H 12 O.

Сравнение масс-спектров стандартного образца МТБЭ со спектрами, заложенными в банк библиотеки масс-спектральных данных NIST 08.L позволило установить его характеристические ионы (основной и подтверждающий). Основной (максимальный) пик в масс-спектре отвечает характеристическому иону с массой m/z 73,0, масса подтверждающих ионов равна m/z 57, 41.

Abundance

3 000 000

2 800 000

2 600 000

2 400 000

2 200 000

2 000 000

1 800 000

1 600 000

1 400 000

1 200 000

1 000 000

800 000

600 000

400 000

Time

Рис. 1. Хроматограмма по полному ионному току стандартного образца МТБЭ (время удерживания 1,57 мин)

Рис. 2. Масс-спектрограмма сравнения масс-спектра стандарта МТБЭ с библиотечным спектром по характеристическим ионам (m/z 73, 57, 41)

Результаты вероятностного поиска по показателю качества совпадения при исследовании стандартных образцов МТБЭ позволили заключить, что его масс-спектры совпали с библиотечными масс-спектрами со значением коэффициента подобия более 90 % при совпадении времени удерживания.

Идентификация МТБЭ в образце крови. В процессе исследований из биологической матрицы (кровь) выделяли метил-трет-бутиловый эфир методом создания равновесной паровой фазы в замкнутом объеме и выполняли газохроматографический анализ [1]. При анализе равновесной паровой фазы МТБЭ с помощью ГХ-МС образец вводили в капиллярную колонку длиной 30 м газового хроматографа Agilent 7890А с масс-селективным детектором 5975С. Для получения воспроизводимости масс-спектров ионизацию молекул МТБЭ проводили в газовой фазе методом электронного удара [4]. Фрагмент хроматограммы по полному ионному току образца крови представлен на рис. 4.

Рис. 3. Фрагмент хроматограммы образца крови, содержащей МТБЭ (время удерживания 1,57 мин), по полному ионному току

Масс-хроматограмму строили по полному ионному току и по характеристическим ионам МТБЭ (m/z 73,1; 57; 41). Применение капиллярной газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектро- метром (ГХ-МС) позволило провести регистрацию хроматограммы образца крови, которая затем была реконструирована по характеристическим ионам. Сканирование исследуемого образца крови по всему диа- пазону масс позволило идентифицировать 10 масс-спектров органических соединений: пропан, 2-метокси-2-метил (метил-трет-бути-ловый эфир), бензол, толуол, 1,3,5-циклогептарин, бензальдегид, фенол 2-метил, бензиловый спирт, бутил 2-метил-пропи-ловый эфир, 1,2-бензолдикарбоксилицило-вой кислоты, дибутилфталат, бутил 4-хлор-фениловый эфир фталевой кислоты с вероятностью совпадения 78-94 %.

На следующем этапе исследований выполняли индивидуальную идентификацию МТБЭ по параметрам удерживания (определено по градуировочным раство- рам) и путем сравнения характеристических ионов масс-спектров с библиотечными спектрами. Для построения масс-хроматограммы использовали интенсивности пиков нескольких ионов из записанного масс-спектра и строили график. Реконструированная масс-хроматограмма по характеристическим ионам МТБЭ представлена на рис. 5. Согласно данным по времени удерживания МТБЭ максимумы на масс-хроматограммах для всех характеристических ионов (m/z 73, 57 и 41) в спектре интенсивных пиков соответствуют этому соединению, подтверждая присутствие МТБЭ в крови.

Рис. 4. Масс-хроматограмма, соответствующая хроматографическому пику МТБЭ (характеристические ионы m/z 73, 57 и 41, время удерживания 1,57 мин)

Рис. 5. Масс-хроматограмма образца крови, содержащей органические соединения: 2-метилпентан, метил-трет-бутиловый эфир и 3-метил-пентан

Наличие на масс-хроматограмме пика с точно заданной массой m/z 73 и временем удерживания 1,57 мин для изучаемого соединения являются весомым доказательством его присутствия в образце крови.

В процессе идентификации на масс-хроматограмме (рис. 6) было установлено наложение пиков ионов, соответствующих органическим соединениям: 2-метил-пентан, метил-трет-бутиловый эфир и 3-ме-тил-пентан.

Наличие на масс-хроматограмме (рис. 6) неразделенных пиков является одной из проблем, возникающих при проведении идентификации и количественного анализа реальных образцов крови [5]. Вопрос о чистоте пика и установлении его однородности представляется особенно актуальным при определении низких содержаний органических соединений в образцах сложного состава, поскольку наложение пиков определяемого аналита и других соединений детектируется как единичный компонент и это приводит к неверным результатам ана- лиза. Исследуя временную зависимость интенсивности тока по отдельным ионам в пределах анализируемого искаженного пика, установили, что времена, соответствующие максимумам ионного тока ионов 2-метилпентан (время удерживания 1,567 мин), метил-трет-бутиловый эфир (время удерживания 1,575 мин) и 3-метил-пентан (время удерживания 1,615 мин) не совпадают. Это является подтверждением того, что обсуждаемый пик образован более чем одним компонентом.

Поскольку времена удерживания трех компонентов, образующих пик, не совпадают, масс-спектры в передней (1,567 мин), средней (1,575) и задней (1,615) частях пика дают чистые масс-спектры каждого из компонентов – 2-метилпентана, метил-трет-бутилового эфира и 3-метил-пентана.

Расшифровку масс-спектра метил-трет-бутилового эфира образца крови выполняли по параметрам удерживания и путем сравнения характеристических ионов масс-спектров с библиотечными спектрами (рис . 7).

1000 0

Масс/спектр МТБЭ образца крови

а

Масс/спектр МТБЭ из бибилотеки

164.7 .......206.9  ,

160    180    200   210

m/z

Рис. 6. Масс-спектр МТБЭ ( а ) и его сравнение с библиотечным масс-спектром ( б ) по характеристическим ионам (m/z основной 73, подтверждающие m/z 57, 41)

Анализ справочной и исследуемой спектрограмм показывает идентичность масс-спектра компонента метил-трет-бути-лового эфира образца крови (верхняя часть рис. 7) и его библиотечного спектра (нижняя часть рис. 7).

На масс-хроматограмме (см . рис . 6) анализируемого образца крови пик со временем удерживания в диапазоне 1,567–1,615 мин является результатом взаимного наложения нескольких индивидуальных пиков соединений-изомеров с совпадающими времена- ми удерживания, поэтому для разделения изомеров предельных углеводородов (2-ме-тилпентан, 3-метилпентан) и метил-трет-бутилового эфира необходимо подобрать новые условия хроматографического разделения. Для этого в процессе исследований обосновано применение последовательно соединенных неполярной колонки с рабочей жидкой фазой на основе поли-метилсилоксана DB-624 60 м×0,32 мм×1,8μm и полярной на основе полиэтиленгликоля с высоким разрешением и низким пределом детектирования HP-1 30 м×0,32 мм×0,25μm. При этих условиях на хроматограмме отсутствует пик, соответствующий изомерам 2-ме- тил пентан и 3-метил пентан, и время удерживания метил-трет-бутилового эфира составляет 11,3 мин. Применение различных колонок дает возможность по изменению индексов удерживания одних и тех же веществ в анализе определиться с точной идентификацией соединений, присутствующих в анализируемом биологическом образце.

Выполненные исследования использованы при разработке метода определения метил-трет-бутилового эфира в крови для оценки воздействия этого соединения на здоровье населения, оценки рисков и проведения исследований в рамках социальногигиенического мониторинга.