Идентификация микобактерий нетуберкулезного типа, изолированных с объектов внешней среды в Республике Татарстан

На сегодняшний день во многих благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота регионах стала очевидной проблема парааллергических реакций, обусловленных циркуляцией в стадах так называемых атипичных микобактерий и других патогенов, которые вызывают аллергические реакции на очищенный туберкулин (ППД – (англ.) PPD – Purified Protein Derivative). Эти реакции зачастую носят массовый характер и затрудняют оценку инфекционного статуса исследуемых животных, что во многих случаях приводит к преждевременному убою здорового продуктивного скота, нанося тем самым огромный экономический ущерб, который связан с потерями от недополучения приплода, молока, мяса и другой продукции, а также от вынужденного выполнения ряда дополнительных диагностических исследований, доставляя тем самым значительный материальный ущерб, который зачастую превышает в десятки раз ущерб от туберкулёза [3].

Ареал нетуберкулезных микобактерий разнообразен и широк. Естественно, их изолируют из биоматериалов от животных и человека при микобактериозах. Кроме того, НТМБ обнаруживают в почве, воде (морской, озерной, речной, водопроводной, плавательных бассейнов), растениях (овощи, сфагновая растительность), в домашней и больничной пыли, местах жизнедеятельности и обитания животных [2]. На объектах окружающей среды, в почве, загрязненных землей опилках нетуберкулезные микобактерии при благоприятных условиях способны размножаться [4]. Соответственно, НТМБ – это микробы окружающей среды, встречающиеся повсеместно в экологических резервуарах, у различных домашних и диких животных, в почве и других объектах внешней среды [5, 6, 8].

Достоинства полимеразной цепной реакции заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения единичных микобактериальных клеток в клиническом материале [1, 7].

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы явилась идентификация микобактерий нетуберкулезного типа, изолированных с объектов внешней среды в Республике Татарстан. В связи с поставленной целью были выдвинуты следующие задачи: провести забор смывов с объектов внешней среды; выделить ДНК микобактерий из проб смывов; провести идентификацию микобактерий нетуберкулезного типа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием набора высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации микобактерий нетуберкулезного типа.

Материал и методы исследований. Работа выполнена в 2018-2021 гг. на кафедре эпизоотологии и паразитологии, в межкафедральной лаборатории иммунологии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», двенадцати животноводческих хозяйствах различных форм собственности Республики Татарстан.

Перед постановкой полимеразной цепной реакции проводилась экстракция ДНК с помощью комплекта реагентов «ДНК-Сорб-В», следуя протоколу фирмы производителя (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

Смывы с объектов внешней среды брали индивидуальными зонд-тампонами с использованием пробирок типа Эппендорф и стерильного натрия хлорид 0,9 %. В качестве объектов внешней среды выбрали: помет синантропных птиц, почву, навозные желоба, подстилку, кормушки, полы и проходы. Общее количество исследованных образцов смывов с объектов внешней среды составило семьдесят два.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе АНК-32 (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия). Реакционная смесь для ПЦР-РВ имела следующий состав (на 1 исследование): фермент Taq-ДНК-полимераза (0,5 мкл); буфер, содержащий хлорид магния (1,5 мкл); дезоксинуклеотидтрифосфаты (0,3 мкл); олигонуклеотидные праймеры (0,5 мкл каждого праймера 10 пмоль); зонд (0,5 мкл 10 пмоль); выделенную (ДНК 10 мкл); деионизированную воду до получения объема одной пробы, равного 15 мкл в программируемом амплификаторе.

Перед началом постановки реакции все необходимые компоненты реакции размораживали и встряхивали на шейкере. Устанавливали пробирки в амплификатор для постановки ПЦР-РВ, отмечали в программе расположение и характеристику проб, выбирали рабочий краситель и устанавливали в программе температурновременной профиль реакции.

ПЦР в режиме реального времени проводилась в следующих условиях: 95 °С – 3 мин, 95 °С – 15 секунд, 60 °С – 30 секунд – 5 повторов; 95 °С – 15 секунд, 60 °С – 30 секунд – детекция – 40 повторов, 72 °С – 30 секунд – 1 повтор.

Результаты анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» (англ. threshold cycle – пороговый цикл) в соответствующей графе в таблице результатов реакции, выведенной в результате машинного анализа. Образец считался положительным, если значение Ct не более 35. Образец считался отрицательным на наличие маркерной ДНК, если для него значение Ct отсутствовало или составляло более 37.

Результат исследований. Смывы для исследований по идентификации микобактерий нетуберкулезного типа поступали из хозяйств, в которых ранее нами были идентифицированы микобактерии нетуберкулезного типа в пробах патологического материала, полученного от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота.

Идентификация микобактерий, выделенных с объектов внешней среды в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан, представлена в таблице 1, 2.

Согласно данным таблицы 1, в ООО «Кичучат» Альметьевского района Республики Татарстан Mycobacterium scrofulaceum идентифицирована из трех объектов внешней среды (помет синантропных птиц, навозные желоба, полы и проходы). В АО «Токарликова», который так же располагается в Альметьевском районе, Mycobacterium kansasii идентифицирована в почве, подстилке и кормушках. .

Таблица 1 – Микобактерии, идентифицированные в смывах с объектов внешней среды животноводческих хозяйств Республики Татарстан

Область забора смыва	8 i1	~    "  V. -к 5 о Й н V	1 „ 8 § i1'	1 i1	^.2	i 51 О i1	1 i 5 "
ООО «Кичучат», Альметьевский район
Помет синантропных птиц							+
Почва
Навозные желоба							+
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы							+
АО «Токарликова», Альметьевский район
Помет синантропных птиц
Почва	+
Навозные желоба
Подстилка	+
Кормушки	+
Полы и проходы
ООО СХП «Свияга» МТФ Давликеево, Апастовский район
Помет синантропных птиц				+	+	+
Почва		+		+			+
Навозные желоба
Подстилка					+		+
Кормушки						+
Полы и проходы					+		+
А/ф «Заинский сахар» МТФ Савалеево, Заинский район
Помет синантропных птиц
Почва
Навозные желоба
Подстилка							+
Кормушки
Полы и проходы							+
МТК «Зай» МТК Куш Елга, Заинский район
Помет синантропных птиц					+	+
Почва				+			+
Навозные желоба	+			+			+
Подстилка					+		+
Кормушки
Полы и проходы	+						+
ООО «Ак Барс Дрожжаное» филиал Большая Акса, Дрожжановский район
Помет синантропных птиц
Почва				+
Навозные желоба
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы
ООО «Ак Барс Дрожжаное» филиал Матаки, Дрожжановский район
Помет синантропных птиц
Почва
Навозные желоба	+
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы

Таблица 2 – Микобактерии, идентифицированные в смывах с объектов внешней среды животноводческих хозяйств Республики Татарстан

Область забора смыва	8 i1	= x о 2 s C3  2  2 cd	8 § i1'	h 8 =2 i1	l^.s	1 51 О i1	2 8 5 ”
ООО «Ак Барс Дрожжаное» филиал Новое Ильмово, Дрожжановский район
Помет синантропных птиц		+
Почва		+
Навозные желоба				+
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы
ООО «Калмурзино», Мензелинский район
Помет синантропных птиц				+	+		+
Почва	+					+	+
Навозные желоба							+
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы							+
ООО «Агро-Основа», Новошешминский район
Помет синантропных птиц
Почва
Навозные желоба
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы				+
А/ф «Сарман», Сармановский район
Помет синантропных птиц						+
Почва	+						+
Навозные желоба							+
Подстилка					+
Кормушки					+
Полы и проходы							+
ООО АПК «Биклянь», Тукаевский район
Помет синантропных птиц	+
Почва
Навозные желоба
Подстилка
Кормушки
Полы и проходы

В ООО СХП «Свияга» МТФ Давликеево Апастовского района в помете синантропных птиц и почве дифференцировали 5 микобактерий: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis в почве, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare в помете синантропных птиц, подстилке, полах и проходах, Mycobacterium avium в помете и кормушках, Mycobacterium scrofulaceum в почве, подстилке, полах и проходах.

В А/ф «Заинский сахар» МТФ Савалеево Заинского района в подстилке, полах и проходах обнаружена

Mycobacterium scrofulaceum. В МТК «Зай» МТК Куш Елга Заинского района в навозных желобах, полах и проходах выявили Mycobacterium kansasii, в почве и навозных желобах Mycobacterium fortuitum, в помете синантропных птиц, подстилке Mycobacterium intracellulare, в помете синантропных птиц Mycobacterium avium, в почве, навозных желобах, подстилке, полах и проходах Mycobacterium scrofulaceum

В Дрожжановском районе в ООО «Ак Барс Дрожжаное» филиал Большая Акса во внешней среде (почва) идентифицирована Mycobacterium fortuitum (Таблица 2). В филиале Матаки ООО «Ак Барс Дрожжаное» Дрожжановского района в навозных желобах идентифицирована Mycobacterium kansasii. В филиале Новое Ильмово ООО «Ак Барс Дрожжаное» Дрожжановского района в помете синантропных птиц и почве дифференцированы Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, в навозных желобах Mycobacterium fortuitum.

В ООО «Калмурзино» Мензелинского района РТ идентифицировано пять микобактерий: Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium – в почве, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare – в помете синантропных птиц, Mycobacterium scrofulaceum – так же в помете синантропных птиц, почве, навозных желобах, полах и проходах.

В ООО «Агро-Основа» Новошешминского района в полах и проходах обнаружена Mycobacterium fortuitum. В А/ф «Сарман» Сармановского района республики на объектах внешней среды дифференцировали четыре микобактерии. Mycobacterium kansasii обнаружена в почве, Mycobacterium intracellulare – в подстилке, кормушках, Mycobacterium avium – в помете синантропных птиц, Mycobacterium scrofulaceum – в почве, навозных желобах, полах и проходах.

В ООО АПК «Биклянь» Тукаевского района в помете синантропных птиц идентифицирована Mycobacterium kansasii.

В результате проведенных исследований установлено, что Mycobacterium kansasii была идентифицирована в 10 из 72 проб с объектов внешней среды, что составило 13,8 % от общего количества исследованных проб, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis – в 3 пробах (4,1 %), Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare – в 8 пробах (11,1 %), Mycobacterium avium – в 5 пробах (7 %), Mycobacterium scrofulaceum – в 18 пробах (25 %).

Заключение. Таким образом, результаты идентификации микобактерий с объектов внешней среды позволяют сделать вывод, что неспецифические аллергические реакции на туберкулин крупного рогатого скота в данных хозяйствах обусловлены контаминацией микобактериями нетуберкулезного типа животноводческих помещений и почв возле ферм.

При попадании микобактерий в организм животных происходит сенсибилизация, что и обуславливает большое количество неспецифических туберкулиновых реакций. Поэтому именно в таких хозяйствах остается актуальным вопрос качественного и своевременного проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по обеззараживанию объектов внешней среды. Наши практические наблюдения свидетельствуют о возможности, в определенных условиях, проведения дополнительной дифференциальной диагностики с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации микобактерий нетуберкулезного типа, которые вызывают проявление парааллергических реакций в стадах.

Резюме

Целью данной работы явилась идентификация микобактерий нетуберкулезного типа, изолированных с объектов внешней среды в Республике Татарстан. В статье приведен результат идентификации микобактерий нетуберкулезного типа в пробах смывов с объектов внешней среды, полученных из хозяйств с установленным видовым составом циркулирующих микобактерий нетуберкулезного типа от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В ходе проведенных исследований нами установлено, что неспецифические аллергические реакции на туберкулин крупного рогатого скота в данных хозяйствах обусловлены контаминацией микобактериями нетуберкулезного типа животноводческих помещений и почв возле ферм.