Идентификация нового генотипа ВЛКРС

Введение. Лейкоз крупного рогатого скота – инфекционная болезнь опухолевой природы, этиологическим агентом которой является одноименный вирус (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus, BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae [2, 3, 4, 5, 6. 7].

Современный подход оценки генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа локуса env -гена возбудителя является более информативным инструментом идентификации генотипов [6, 7], нежели предложенные ранее стратегии типизации, основанные на интерпретации генерируемых env -ПЦР-ПДРФ-профилей [3, 4, 5].

Дальнейшее же развитие таксономической классификации BLV и совершенствование способов генотипической идентификации напрямую связано с получением новых знаний о генетическом многообразии возбудителя по мере выявления оригинальных изолятов ВЛКРС [1, 2].

Материалы и методы. При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением внешних (env5032+env5608) и внутренних (env5099+env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env -гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 3].

Секвенирование продуктов амплификации локуса  env-гена выявленных изолятов провируса ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим» с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных олигонуклеотидов.

Секвенированные последовательности локуса env -гена изолятов BLV «N10» (GenBank A/N: HM102355), «N28» (GenBank A/N: HM102356), «N72» (GenBank A/N: JF683619) и «N174» (GenBank A/N: JF713455) были выравнены по длине 400 нуклеотидов c соответствующими опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.

Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII , SspI , HphI , HaeIII , BstYI .

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

ПЦР-ПДРФ-продукты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Результаты исследования и их обсуждение. Согласно результатам филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса env -гена типовых представителей известных генотипов ВЛКРС было установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе Республики Татарстан, принадлежал к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах Республики Татарстан, относились к 4-му генотипу BLV.

Еще один изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе Республики Татарстан, характеризовался признаком нового, ранее не обоснованного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входили, на момент обоснования нами нового генотипа BLV [1], близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (GenBank A/N: HM563766); «3-41» (GenBank A/N: HM563767]) и Хорватии [«M1/ELG_Cro/08» (GenBank A/N: GU724606)], соответственно.

Необходимо отметить, что чуть позже выхода нашей предыдущей статьи [1] с обоснованием 8-го генотипа BLV, в другой научной публикации [2] уже хорватских исследователей был отражен результат сравнительного филогенетического анализа выявленных в Хорватии изолятов ВЛКРС, также подтверждающий факт наличия нового генотипа в таксономической классификации BLV.

В настоящей же работе нами представлена дендрограмма типовых представителей известных генотипов ВЛКРС с включением в филогенетическое дерево всех депонированных в GenBank NCBI (по состоянию на май 2012 г.) нуклеотидных последовательностей env -гена изолятов нового 8-го генотипа BLV (рис. 1).

Полученные результаты наглядно демонстрируют присутствие автономного 8-го генотипического кластера (рис. 1).

Дополнительно, в рамках совершенствования схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией ВЛКРС, в процессе системного анализа рестрикционных картирований локуса env -гена известных представителей BLV, нами подобраны новые условия идентификации по 5 эндонуклеазам рестрикции ( PvuII , SspI , HphI , HaeIII и BstYI ). Обобщенная информация с интерпретацией полученных env -ПЦР-ПДРФ-профилей BLV представлена в табл. 1.

--- LO (UMI 02355)

. "I---—— 3(1187872)

BG (EF06563 8)

---------- N72 (JF683619)

4-2 ЙМ5637В1)

— CROC (EF065639)

ERAS-2 (EPO65636)

-----CRLjC-1 (EF065655)

— I 51 {AY185360}

50(DQ0 5 9421)

--------PL-1238 (PJ8O8582)

--------------12 (S83530)

3O(DQO59417)

--------- ^28 {HM] 023 5 6) ---- 1 (AY515280)

-------14 (AY515274)

I--- USCA- 1 (EF065647)

_ । USCA-2 (Ef-065648) ---------JPFU (EFO65 650) _

--АЫ453 (EJ808 577) ------PL-4960 (FJ808 590)

AL-164 (FJ806574}

• - ARGSF 8 (AE 485773)

— N 174 (JF7I3455]

.  3-4 3 {HM 5 63 767)

_ 4-1 {HM563 766)

Е1О£гаМПЮ9 (JN99OO73)

MI /ELG Cro/08 (GU724606)

EU3(^EM/0 8(JN9900 69}

ELG Gratis AM (JN990070)

ELG CratiRA/to (J N 990071)

ELG Cto/VRAM {JN99O072)

^ Сга.'ЫО/W (JN990074)

KurdEtan {EU266062)

- VdM {М35239)

— Cow 52 7 (AF007764)

------23 (L'87873)

AL-63 {FJ8O857I)

______I AL-2106 {H808 578)

■■ UnK’OOU (Ш9$$

I-------------------------------------1 0005

Рис. 1/ Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV ( env -ген) [MEGA-4: алгоритм NJ, 400 nt, 40 seq.]

Табл. 1. Усовершенствованная схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией

Г	Изолят	GenBank A/N	ПЦР-продукт (п.н.)	ПДРФ-фрагменты (п.н.)					К	N
				PvuII	SspI	HphI	HaeIII	BstYI
1-й	AL-63	FJ808571	444	444	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	198/128/118	1	50
1-й	Cow 527	AF007764	444	444	399/45	224/220	285/94/32/27/6	198/128/118	2	8
1-й	23	U87873	444	444	399/45	224/220	312/94/32/6	198/128/118	3	1
1-й	AL-2106	FJ808578	444	444	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	246/198	4	39
1-й	UruC06II	FM955558	444	444	399/45	224/220	285/94/32/27/6	246/198	5	1
1-й	VdM	M35239	444	444	399/45	224/181/39	198/94/87/32/27/6	316/128	6	1
1-й	Kurdistan	EU266062	444	444	399/45	220/196/28	198/119/94/27/6	198/128/118	7	1
2-й	AL-164	FJ808574	444	280/164	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	198/128/118	8	34
2-й	PL-4960	FJ808590	444	280/164	399/45	224/220	198/87/49/45/32/27/6	198/128/118	9	1
2-й	ARGSF8	AF485773	444	280/164	399/45	444	198/94/87/32/27/6	198/128/118	10	1
2-й	AL-1453	FJ808577	444	280/164	444	224/220	198/94/87/32/27/6	198/128/118	11	1
3-й	USCA-1	EF065647	444	444	399/45	444	285/94/32/21/6/6	198/128/96/22	12	1
3-й	USCA-2	EF065648	444	444	399/45	444	285/94/32/27/6	198/128/96/22	13	2
3-й	JPFU	EF065650	444	444	399/45	444	285/94/32/27/6	198/128/118	14	1
4-й	N10	HM102355	444	280/164	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	444	15	25
4-й	3	U87872	444	444	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	444	16	1
5-й	CRAS-2	EF065636	444	280/164	399/45	224/181/39	198/94/87/32/27/6	316/128	17	7
5-й	CRGC	EF065639	444	280/164	399/45	224/181/39	285/94/32/27/6	316/128	18	1
5-й	CRLC-1	EF065655	444	280/164	444	224/181/39	198/94/87/32/27/6	316/128	19	2
6-й	PL-1238	FJ808582	444	444	399/45	224/220	285/94/32/27/6	316/128	20	3
6-й	151	AY185360	444	444	399/45	224/220	198/94/87/32/27/6	316/128	21	7
7-й	N28	HM102356	444	444	444	224/137/83	198/94/87/32/27/6	294/128/22	22	1
7-й	1	AY515280	444	444	444	224/137/83	198/94/87/32/27/6	316/128	23	16
7-й	I2	S83530	444	444	444	224/220	285/94/32/27/6	316/128	24	1
7-й	14	AY515274	444	444	444	145/137/83/79	198/94/87/32/27/6	316/128	25	1
7-й	30	DQ059417	444	444	444	444	198/87/49/45/32/27/6	316/128	26	1
8-й	N174	JF713455	444	444	399/45	224/220	225/94/87/32/6	316/128	27	1
8-й	3-43	HM563767	444	444	399/45	224/220	225/94/87/32/6	198/128/118	28	7
8-й	ELG_Cro/VRA/09	JN990072	444	444	444	224/220	225/94/87/32/6	198/128/118	29	2

Обозначения: Г – генотип ; К – комбинация ; N – количество проанализированных изолятов BLV с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей, чьи нуклеотидные последовательности локуса env -гена депонированы в базу данных GenBank (по состоянию на май 2012 г).

Так, 1-ый генотип BLV характеризуется наличием 7 комбинаций env -ПЦР-ПДРФ-профилей (К1-7), 2-ой генотип – четырёх комбинаций (К8-11), 3-ий генотип – наличием трёх комбинаций (К12-14); 4-ый генотип – двух комбинаций (К15-16); 5-ый генотип – трех комбинаций (К17-19); 6-ой генотип – двух комбинаций (К20-21), 7-ой генотип – пяти комбинаций (К22-26) и 8 генотип ВЛКРС – наличием трех комбинации (К27-29) env -ПЦР-ПДРФ-профилей BLV (табл. 1).

Следует подчеркнуть, что целый ряд комбинаций env -ПЦР-ПДРФ-профилей на данный момент представлен единственными нуклеотидными последовательностями локуса env -гена изолятов ВЛКРС, депонированными в GenBank NCBI, в числе которых и выявленные нами изоляты N28 (22 комбинация, 7-ой генотип) и N174 (27 комбинация, 8-ой генотип), соответственно (табл. 1).

Примечательно, что для идентификации 4-го генотипа ВЛКРС достаточно даже одной эндонуклеазы рестрикции – BstYI . Охарактеризованный в нашей работе новый 8-ой генотип ВЛКРС также может быть идентифицирован с использованием одной единственной рестриктазы – HaeIII . С применением двух ферментов могут быть определены представители 2-го [ PvuII и BstYI ], 3-го [ HphI и HaeIII ] и 5-го [ PvuII и BstYI ] генотипов BLV (табл. 1).

В целях же исчерпывающей идентификации генотипов ВЛКРС целесообразно руководствоваться полной картиной env -ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей BLV по локусу env -гена.

ЛИТЕРАТУРА. 1. Шаева, А.Ю. Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики Татарстан / А.Ю. Шаева, Р.Р. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, А.М. Алимов, М.Ш. Тагиров // Ученые записки КГАВМ. – Казань, 2011. – Т. 208. – С. 330-337. 2. Balic, D. Identification of a new genotype of bovine leukemia virus / D. Balic, I. Lojkic, M. Periskic, T. Bedekovic, A. Jungic, N. Lemo, B. Roic, Z. Cac, L. Barbic, J. Madic // Arch. Virol. – 2012 – Apr 10 [Epub ahead of print]. 3. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr – 2001. – V. 114. – № 7-8. – P. 252-256. 4. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner // Virology –1997. – V. 237. – № 2. – P. 261-269. 5. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. González, H. Sentsui // Virus Res. – 2002. – V. 86. – № 1-2. – P. 101-110. 6. Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in

South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. – 2010. – V. 155. – № 4. – P. 481-489. 7. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. – 2009. – V. 90. – № 11. – P. 2788-2797.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОГО ГЕНОТИПА ВЛКРС

Шаева А.Ю., Гараева З.Р., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Алимов А.М. Резюме

На основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env -гена провируса BLV охарактеризован новый генотип ВЛКРС, факт существования которого также подтвержден хорватскими исследователями. Усовершенствована схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией данного возбудителя.

IDENTIFICATION OF A NEW BLV GENOTYPE

Shaeva A.Y., Garaeva Z.R., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Alimov A.M. Summary

Based on phylogenetic analysis of the BLV env -gene sequences was characterized a new genotype of bovine leukemia virus, the existence of which is also confirmed by Croatian researchers. A scheme of PCR-RFLP-genotyping of BLV in accordance with the phylogenetic classification of this pathogen was improved.