Идентификация уровня плоидности растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников тритикале (×Triticosecale Wittmack)

УДК 633.112.9:631.52(470.4)

Введение. Процесс создания сорта занимает 12–14 лет, из которых почти половина затрачивается на достижение гомозиготности потомства, которая гарантирует отличимость, однородность и стабильность будущего сорта. Широко востребованным методом быстрого достижения гомозиготности в настоящее время является гаплои-дия. Удвоение хромосом гаплоидов приводит к получению DH-линий (потомств удвоенных гаплоидов) всего за одну генерацию. DH-линии используются в теоретических исследованиях для картирования локусов количественных признаков (QTLs), в маркер-опосредованной селекции, геномном редактировании, а также практической селекции. Список сортов злаков, полученных на основе DH-линий, отражен в публикациях Humphreys and Knox [1] и Kishii and Singh [2]. В настоящее время гаплоидные растения получены у 384 видов, перечень которых приведен в обзоре Segui-Simarro et al. [3]. Как правило, гаплоидные спорофиты получают в условиях in vitro из культивируемых гаметофитных (гаплоидных) клеток [4; 5]. Наиболее востребованными методами для получения гаплоидов злаков являются культура пыльников, культура изолированных микроспор и отдаленная гибридизация с последующей элиминацией хромосом вида-опылителя [6; 7]. В отличие от пшеницы мягкой эффективность метода селективной элиминации хромосом у тритикале низкая при использовании различных опылителей [8]. Важной составной частью технологий получения удвоенных гаплоидов (DH-линий) в культуре пыльников и изолированных микроспор является определение уровня плоидности, т.к. растения-регенеранты могут быть не только гаплоидами, но и спонтанными диплоидами [9]. Для анализа уровня плоидности большого числа растений требуются доступные в использовании методы, которые отличаются высокой производительностью [10]. Связь размера генома с параметрами устьичных клеток изучена на большом диапазоне видов [11]. У двудольных растений показателем, тесно коррелирующим с уровнем плоидно-сти, служит число хлоропластов [12]. В ранее проведенных нами исследованиях было установлено, что использование этого показателя у тритикале, в отличие от двудольных, усложняется их особым строением – клетки вытянуты в длину, сужены в середине, имеют гантелевидную форму. Хлоропласты плотно расположены в расширенных концах клеток [13].

В связи с этим актуально изучение других характеристик устьичного аппарата как потенциальных косвенных маркеров гаплоидов и спонтанных диплоидов растений-регенерантов тритикале.

Цель исследований – изучить возможность применения параметров устьичных клеток (длины клеток и плотности их размещения на единице площади) для оценки уровня пдоидности регенерантов, полученных в культуре пыльников тритикале ( × Triticosecale Wittmack).

Материалы и методы. Объектом исследований служили растения-регенеранты, полученные методом андрогенеза in vitro в культуре пыльников, пяти селекционных образцов озимой гексаплоидной тритикале селекции ФГБНУ «ФАНЦ Юго-Востока».

Исследования проводили в течение 2024– 2025 гг. в лаборатории клеточной селекции ФГБНУ «ФАНЦ Юго-Востока». Каждый генотип был представлен 10 растениями-регенерантами. Для определения плотности устьиц изучали 3–5 микроскопических полей на лист. Приготовление препаратов для исследований проведено согласно прописи В.П. Клименко с соавторами [11]. Препараты изучали на микроскопе Nexcope NE 620 (Китай) с использованием объектива 40х. В качестве контроля служили параметры устьичных клеток растений с диплоидным числом хромосом (самоопыленные растения сорта Зубр). Снимки сделаны камерой Microscope Digital Camera Bus51B-700M (Китай). Для проведения измерений длины устьичных клеток применялась программа ImageView, версия х64,4.11.20977.20220605.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистического пакета «Статистический и биометрико-генетический анализ в растениеводстве и селекции» (AGROS версия 2.09). Рассчитывали средние и стандартные отклонения. Для измерения силы и направления линейной связи между размером устьичных клеток и плотностью их размещения на единице площади использовали алгоритм линейного корреляционного анализа Пирсона.

Результаты и обсуждение. Изучение длины замыкающих клеток устьиц у 40 растений-регенерантов тритикале, полученных в культуре пыльников, выявило две группы растений, статистически значимо различающихся по выраженности этого показателя. У первой группы значения варьировали в пределах от 58,8 до 63,2 мкм, у второй – от 84,4 до 88,3 мкм (табл. 1).

Таблица 1

Длина замыкающих клеток устьиц у регенерантов тритикале, полученных в культуре

пыльников

Table 1

Length of the guard cells of the stomata in triticale regenerants obtained in anthers culture

Генотип / № растения	Длина замыкающих клеток, мкм		Генотип / № растения	Длина замыкающих клеток, мкм
	гаплоиды	спонтанные диплоиды		гаплоиды	спонтанные диплоиды
Контроль	-			-	84,6d
96			99
1	62,2a		1		84,4bcd
2	61,3a		2	59,7a
3	61,1a		3	60,8a
4	62,6a		4	61,4a
5	60,7a		5	60,5a
6	61,4a		6		84,8cd
7	60,9a		7	61,3a
8		86,0bcd	8	60,4a
9		87,7cd	9		84,9d
10		88,3d	10	60,4
98			100
1	60,4a		1		84,8b
2	60,5a		2	62,3a
3	59,6a		3	61,7a
4	59,7a		4	62,0a
5	60,6a		5	63,2a
6		86,1b	6	62,8a
7	61,6a		7	61,6a
8	58,8a		8	61,9a
9	61,3a		9	61,4a
10	61,6a		10	61,8a

Примечание: варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, не различаются по критерию Дункана

Второй морфометрический показатель – плотность расположения устьиц на 1 мм2 – также отличался у растений разных групп. У предполагаемых гаплоидов его значение для 33 растений разных генотипов варьировало от 29,8 до 33,0 шт., у спонтанных диплоидов для семи растений тех же генотипов – от 18,8 до 21,8 шт. По изученному показателю растения разных групп оказались достаточно однородными, что позволяет сделать вывод о незначительном влиянии генотипа на этот показатель в пределах изученной выборки. Выявленные морфометрические показатели для спонтанных диплоидов не проявили значимых различий с показателями контрольных растений тритикале, полученных из семян (табл. 2).

В среднем по четырем генотипам длина устьичных клеток гаплоидных растений составила 61,6 мкм, диплоидных – 86,6 мкм, плотность расположения на 1 мм2 – 31,2 и 20,2 шт. соответственно.

Теоретически, микроспоры содержат гаплоидный набор хромосом, а растения, полученные из таких микроспор, являются гаплоидными. Однако в некоторых случаях на ранних стадиях эмбриогенеза происходит спонтанное удвоение хромосом, которое дает начало удвоенным гаплоидам (DHs). Геномная дупликация может происходить за счет эндомитоза, эндоредупликации, слияния ядер и образования нередуцированных гамет. Частота спонтанной диплоидизации зависит от генотипа, вида применяемого стресса и его интенсивности, а также условий культивирования. Феномен спонтанного удвоения числа хромосом проявляется у различных видов и позволяет сокращать время и затраты на получение DH-линий [7]. Как было установлено, длина замыкающих клеток устьиц у регенерантов тритикале соответствует уровню плоидности, выявленному прямым цитогенетическим методом – подсчетом числа хромосом в кончиках корней [11]. Семь растений из 40 изученных оказались спонтанными диплоидами с частотой спонтанного удвоения хромосом в 17,5 %.

Таблица 2

Плотность расположения устьиц у регенерантов тритикале, полученных в культуре пыльников

Table 2

Density of stomata in triticale regenerants obtained in anthers culture

Генотип / № растения	Плотность расположения устьиц шт/мм2		Генотип / № растения	Плотность расположения устьиц шт/мм2
	гаплоиды	спонтанные диплоиды		гаплоиды	спонтанные диплоиды
Контроль	-			-	20,8a
96			99
1	29,8bcd		1		19,4a
2	30,8d		2	32,6d
3	30,8d		3	32,4d
4	32,0d		4	31,8d
5	30,4cd		5	31,8cd
6	30,6d		6		18,8a
7	31,0d		7	31,2bcd
8		20,4a	8	31,8d
9		21,8a	9		19,2a
10		21,6a	10	31,8d
98			100
1	30,4b		1		18,8а
2	32,8b		2	30,2b
3	33,0b		3	31,0b
4	32,8b		4	30,4b
5	32,8b		5	30,2b
6		19,4a	6	30,2b
7	31,4b		7	31,4b
8	30,4b		8	30,2b
9	32,2b		9	30,6b
10	31,4b		10	31,0b

Примечание: варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, не различаются по критерию Дункана

Выявлена сильная статистически достоверная отрицательная корреляция между длиной устьичных клеток и плотностью их размещения на единице площади. Значение коэффициент корреляции составило r = -0,96**, т.е. зависимость между изученными показателями приближена к функциональной.

Заключение. Проведенные исследования подтвердили взаимосвязь морфометрических показателей устьичного аппарата в эпидермисе листа (размера устьичных клеток и плотности их расположения) с гаплоидным и диплоидным числом хромосом регенерантов тритикале, полученных в культуре изолированных пыльников. Длина устьичных клеток гаплоидных растений составила 61,6 мкм, диплоидных – 86,6 мкм, плотность расположения на 1 мм² – 31,2 и 20,2 шт. соответственно. Значение коэффициента корреляции составило r = -0,96**, т.е. зависимость между изученными показателями сильная отрицательная и приближена к функциональной.