Идентификация уровня плоидности растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников тритикале (×Triticosecale Wittmack)
Автор: Жилин С.В., Дьячук Т.И., Хомякова О.В., Акинина В.Н., Калашникова Э.В., Генералова О.А., Куликова В.П.
Рубрика: Селекция, семеноводство и биотехнология сельскохозяйственных растений
Статья в выпуске: 3 (203), 2025 года.
Бесплатный доступ
Для ускоренного создания сортов в селекции растений широко применяется гаплоидия, позволяющая сокращать сроки создания гомозиготных линий в среднем на 5–7 лет. Наиболее эффективным методом получения гаплоидных растений тритикале является культура пыльников in vitro. Наряду с гаплоидами растениярегенеранты, полученные этим методом, могут быть спонтанными диплоидами. В этой связи определение уровня плоидности является важной составной частью технологии получения удвоенных гаплоидов (DHлиний). Цель исследований – изучить возможность применения параметров устьичных клеток для оценки уровня плоидности регенерантов, полученных в культуре пыльников тритикале (×Triticosecale Wittmack). Установлено, что параметры устьичных клеток коррелируют с числом хромосом регенерантов и могут использоваться для массового скрининга уровня плоидности. По изученным показателям растения с одинаковой плоидностью оказались достаточно однородными, что позволяет сделать вывод о незначительном влиянии генотипа на этот показатель в пределах изученной выборки. Следует также отметить, что значимых различий между спонтанными диплоидами из культуры пыльников и контроля (растений тритикале, полученных из семян) не наблюдалось. Установлено, что длина устьичных клеток равна 61,6 ± 0,8 мкм для гаплоидных растений и 86,6 ± 0,4 мкм для спонтанных диплоидов. Плотность расположения клеток на 1 мм2 составляет 31,2 ± 0,3 и 20,2 ± 0,4 шт. для гаплоидов и диплоидов соответственно. Семь растений из сорока изученных оказались спонтанными диплоидами с частотой спонтанного удвоения хромосом в 17,5 %. Результаты косвенного определения уровня плоидности регенерантов подтверждены прямым цитогенетическим методом – подсчетом числа хромосом в кончиках корней растенийрегенерантов. Выявлена сильная статистически достоверная отрицательная корреляция между длиной устьичных клеток и плотностью их размещения на единице площади (r = 0,96**), т.е. зависимость между изученными показателями приближена к функциональной.
Тритикале, селекция, гаплоидия, культура пыльников, устьичные клетки
Короткий адрес: https://sciup.org/142246270
IDR: 142246270 | УДК: 633.112.9:631.52(470.4) | DOI: 10.25230/2412-608X-2025-3-203-29-34
Identification of the ploidy level of triticale (×Triticosecale Wittmack) regenerant plants obtained by the anther culture method
Haploidy is widely used in plant breeding to accelerate the development of new varieties, reducing the time required to create homozygous lines by an average of 5–7 years. The in vitro anther culture method is the most effective for the production of haploid triticale plants. Along with haploids, regenerated plants obtained by this method may be spontaneous diploids. Therefore, determining the level of ploidy is an important part of the technology for obtaining doubled haploids (DH lines). The aim of the research is to study the possibility of using stomatal cell parameters to evaluate the ploidy level of regenerants obtained in triticale (×Triticosecale Wittmack) anther culture. It has been established that stomatal cell parameters correlate with the number of chromosomes in regenerants and can be used to screen ploidy levels on a large scale. Based on the studied indicators, plants with the same ploidy level were found to be sufficiently homogeneous. This allows us to conclude that genotype has an insignificant effect on this indicator within the studied samples. No significant differences were observed between spontaneous diploids from anther culture and controls (triticale plants obtained from seeds). The length of stomatal cells was found to be 61.6 ± 0.8 μm for haploid plants and 86.6 ± 0.4 μm for spontaneous diploids. The cell density per 1 mm² is 31.2 ± 0.3 pcs and 20.2 ± 0.4 pcs, for haploids and diploids, respectively. Of the forty plants studied, seven turned out to be spontaneous diploids, exhibiting a chromosome doubling frequency of 17.5%. The indirect determination of the ploidy level of regenerants was confirmed by a direct cytogenetic method of counting the number of chromosomes in regenerant plant root tips. A strong statistically significant negative correlation was found between stomatal cell length and density per unit area (r = 0.96**); i.e., the relationship between these two indicators is nearly functional.
Текст научной статьи Идентификация уровня плоидности растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников тритикале (×Triticosecale Wittmack)
УДК 633.112.9:631.52(470.4)
Введение. Процесс создания сорта занимает 12–14 лет, из которых почти половина затрачивается на достижение гомозиготности потомства, которая гарантирует отличимость, однородность и стабильность будущего сорта. Широко востребованным методом быстрого достижения гомозиготности в настоящее время является гаплои-дия. Удвоение хромосом гаплоидов приводит к получению DH-линий (потомств удвоенных гаплоидов) всего за одну генерацию. DH-линии используются в теоретических исследованиях для картирования локусов количественных признаков (QTLs), в маркер-опосредованной селекции, геномном редактировании, а также практической селекции. Список сортов злаков, полученных на основе DH-линий, отражен в публикациях Humphreys and Knox [1] и Kishii and Singh [2]. В настоящее время гаплоидные растения получены у 384 видов, перечень которых приведен в обзоре Segui-Simarro et al. [3]. Как правило, гаплоидные спорофиты получают в условиях in vitro из культивируемых гаметофитных (гаплоидных) клеток [4; 5]. Наиболее востребованными методами для получения гаплоидов злаков являются культура пыльников, культура изолированных микроспор и отдаленная гибридизация с последующей элиминацией хромосом вида-опылителя [6; 7]. В отличие от пшеницы мягкой эффективность метода селективной элиминации хромосом у тритикале низкая при использовании различных опылителей [8]. Важной составной частью технологий получения удвоенных гаплоидов (DH-линий) в культуре пыльников и изолированных микроспор является определение уровня плоидности, т.к. растения-регенеранты могут быть не только гаплоидами, но и спонтанными диплоидами [9]. Для анализа уровня плоидности большого числа растений требуются доступные в использовании методы, которые отличаются высокой производительностью [10]. Связь размера генома с параметрами устьичных клеток изучена на большом диапазоне видов [11]. У двудольных растений показателем, тесно коррелирующим с уровнем плоидно-сти, служит число хлоропластов [12]. В ранее проведенных нами исследованиях было установлено, что использование этого показателя у тритикале, в отличие от двудольных, усложняется их особым строением – клетки вытянуты в длину, сужены в середине, имеют гантелевидную форму. Хлоропласты плотно расположены в расширенных концах клеток [13].
В связи с этим актуально изучение других характеристик устьичного аппарата как потенциальных косвенных маркеров гаплоидов и спонтанных диплоидов растений-регенерантов тритикале.
Цель исследований – изучить возможность применения параметров устьичных клеток (длины клеток и плотности их размещения на единице площади) для оценки уровня пдоидности регенерантов, полученных в культуре пыльников тритикале ( × Triticosecale Wittmack).
Материалы и методы. Объектом исследований служили растения-регенеранты, полученные методом андрогенеза in vitro в культуре пыльников, пяти селекционных образцов озимой гексаплоидной тритикале селекции ФГБНУ «ФАНЦ Юго-Востока».
Исследования проводили в течение 2024– 2025 гг. в лаборатории клеточной селекции ФГБНУ «ФАНЦ Юго-Востока». Каждый генотип был представлен 10 растениями-регенерантами. Для определения плотности устьиц изучали 3–5 микроскопических полей на лист. Приготовление препаратов для исследований проведено согласно прописи В.П. Клименко с соавторами [11]. Препараты изучали на микроскопе Nexcope NE 620 (Китай) с использованием объектива 40х. В качестве контроля служили параметры устьичных клеток растений с диплоидным числом хромосом (самоопыленные растения сорта Зубр). Снимки сделаны камерой Microscope Digital Camera Bus51B-700M (Китай). Для проведения измерений длины устьичных клеток применялась программа ImageView, версия х64,4.11.20977.20220605.
Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистического пакета «Статистический и биометрико-генетический анализ в растениеводстве и селекции» (AGROS версия 2.09). Рассчитывали средние и стандартные отклонения. Для измерения силы и направления линейной связи между размером устьичных клеток и плотностью их размещения на единице площади использовали алгоритм линейного корреляционного анализа Пирсона.
Результаты и обсуждение. Изучение длины замыкающих клеток устьиц у 40 растений-регенерантов тритикале, полученных в культуре пыльников, выявило две группы растений, статистически значимо различающихся по выраженности этого показателя. У первой группы значения варьировали в пределах от 58,8 до 63,2 мкм, у второй – от 84,4 до 88,3 мкм (табл. 1).
Таблица 1
Длина замыкающих клеток устьиц у регенерантов тритикале, полученных в культуре
пыльников
Table 1
Length of the guard cells of the stomata in triticale regenerants obtained in anthers culture
|
Генотип / № растения |
Длина замыкающих клеток, мкм |
Генотип / № растения |
Длина замыкающих клеток, мкм |
||
|
гаплоиды |
спонтанные диплоиды |
гаплоиды |
спонтанные диплоиды |
||
|
Контроль |
- |
- |
84,6d |
||
|
96 |
99 |
||||
|
1 |
62,2a |
1 |
84,4bcd |
||
|
2 |
61,3a |
2 |
59,7a |
||
|
3 |
61,1a |
3 |
60,8a |
||
|
4 |
62,6a |
4 |
61,4a |
||
|
5 |
60,7a |
5 |
60,5a |
||
|
6 |
61,4a |
6 |
84,8cd |
||
|
7 |
60,9a |
7 |
61,3a |
||
|
8 |
86,0bcd |
8 |
60,4a |
||
|
9 |
87,7cd |
9 |
84,9d |
||
|
10 |
88,3d |
10 |
60,4 |
||
|
98 |
100 |
||||
|
1 |
60,4a |
1 |
84,8b |
||
|
2 |
60,5a |
2 |
62,3a |
||
|
3 |
59,6a |
3 |
61,7a |
||
|
4 |
59,7a |
4 |
62,0a |
||
|
5 |
60,6a |
5 |
63,2a |
||
|
6 |
86,1b |
6 |
62,8a |
||
|
7 |
61,6a |
7 |
61,6a |
||
|
8 |
58,8a |
8 |
61,9a |
||
|
9 |
61,3a |
9 |
61,4a |
||
|
10 |
61,6a |
10 |
61,8a |
||
Примечание: варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, не различаются по критерию Дункана
Второй морфометрический показатель – плотность расположения устьиц на 1 мм2 – также отличался у растений разных групп. У предполагаемых гаплоидов его значение для 33 растений разных генотипов варьировало от 29,8 до 33,0 шт., у спонтанных диплоидов для семи растений тех же генотипов – от 18,8 до 21,8 шт. По изученному показателю растения разных групп оказались достаточно однородными, что позволяет сделать вывод о незначительном влиянии генотипа на этот показатель в пределах изученной выборки. Выявленные морфометрические показатели для спонтанных диплоидов не проявили значимых различий с показателями контрольных растений тритикале, полученных из семян (табл. 2).
В среднем по четырем генотипам длина устьичных клеток гаплоидных растений составила 61,6 мкм, диплоидных – 86,6 мкм, плотность расположения на 1 мм2 – 31,2 и 20,2 шт. соответственно.
Теоретически, микроспоры содержат гаплоидный набор хромосом, а растения, полученные из таких микроспор, являются гаплоидными. Однако в некоторых случаях на ранних стадиях эмбриогенеза происходит спонтанное удвоение хромосом, которое дает начало удвоенным гаплоидам (DHs). Геномная дупликация может происходить за счет эндомитоза, эндоредупликации, слияния ядер и образования нередуцированных гамет. Частота спонтанной диплоидизации зависит от генотипа, вида применяемого стресса и его интенсивности, а также условий культивирования. Феномен спонтанного удвоения числа хромосом проявляется у различных видов и позволяет сокращать время и затраты на получение DH-линий [7]. Как было установлено, длина замыкающих клеток устьиц у регенерантов тритикале соответствует уровню плоидности, выявленному прямым цитогенетическим методом – подсчетом числа хромосом в кончиках корней [11]. Семь растений из 40 изученных оказались спонтанными диплоидами с частотой спонтанного удвоения хромосом в 17,5 %.
Таблица 2
Плотность расположения устьиц у регенерантов тритикале, полученных в культуре пыльников
Table 2
Density of stomata in triticale regenerants obtained in anthers culture
|
Генотип / № растения |
Плотность расположения устьиц шт/мм2 |
Генотип / № растения |
Плотность расположения устьиц шт/мм2 |
||
|
гаплоиды |
спонтанные диплоиды |
гаплоиды |
спонтанные диплоиды |
||
|
Контроль |
- |
- |
20,8a |
||
|
96 |
99 |
||||
|
1 |
29,8bcd |
1 |
19,4a |
||
|
2 |
30,8d |
2 |
32,6d |
||
|
3 |
30,8d |
3 |
32,4d |
||
|
4 |
32,0d |
4 |
31,8d |
||
|
5 |
30,4cd |
5 |
31,8cd |
||
|
6 |
30,6d |
6 |
18,8a |
||
|
7 |
31,0d |
7 |
31,2bcd |
||
|
8 |
20,4a |
8 |
31,8d |
||
|
9 |
21,8a |
9 |
19,2a |
||
|
10 |
21,6a |
10 |
31,8d |
||
|
98 |
100 |
||||
|
1 |
30,4b |
1 |
18,8а |
||
|
2 |
32,8b |
2 |
30,2b |
||
|
3 |
33,0b |
3 |
31,0b |
||
|
4 |
32,8b |
4 |
30,4b |
||
|
5 |
32,8b |
5 |
30,2b |
||
|
6 |
19,4a |
6 |
30,2b |
||
|
7 |
31,4b |
7 |
31,4b |
||
|
8 |
30,4b |
8 |
30,2b |
||
|
9 |
32,2b |
9 |
30,6b |
||
|
10 |
31,4b |
10 |
31,0b |
||
Примечание: варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, не различаются по критерию Дункана
Выявлена сильная статистически достоверная отрицательная корреляция между длиной устьичных клеток и плотностью их размещения на единице площади. Значение коэффициент корреляции составило r = -0,96**, т.е. зависимость между изученными показателями приближена к функциональной.
Заключение. Проведенные исследования подтвердили взаимосвязь морфометрических показателей устьичного аппарата в эпидермисе листа (размера устьичных клеток и плотности их расположения) с гаплоидным и диплоидным числом хромосом регенерантов тритикале, полученных в культуре изолированных пыльников. Длина устьичных клеток гаплоидных растений составила 61,6 мкм, диплоидных – 86,6 мкм, плотность расположения на 1 мм2 – 31,2 и 20,2 шт. соответственно. Значение коэффициента корреляции составило r = -0,96**, т.е. зависимость между изученными показателями сильная отрицательная и приближена к функциональной.
