Иммунный статус и спектр цитокинов как прогностические признаки риска тяжелого течения заболевания и эффективности интенсивной терапии пациентов с коронавирусной инфекцией COVID-19

Садыков Валентин Фидаильевич – анестезиолог-реаниматолог (e-mail: ; тел.: 8 (910) 468-63-98; ORCID: .

Полтавцева Римма Алексеевна – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: ; тел.: 8 (916) 549-01-68; ORCID: .

Чаплыгина Алина Вадимовна – младший научный сотрудник лаборатории клеточных механизмов патологии памяти (e-mail: ; тел.: 8 (925) 927-63-14; ORCID: .

Бобкова Наталья Викторовна – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией клеточных механизмов патологии памяти (e-mail: ; тел.: 8 (903) 184-52-77; ORCID: .

является важным звеном в функционировании ре-нин-ангиотензиновой системы (РАС), которой принадлежит центральная роль в поддержании гомеостаза в организме путем регуляции взаимодействия сердечно-сосудистой, дыхательной, системы водносолевого и углеводного обменов и регуляции кровяного давления [5]. SARS-CoV-2, взаимодействуя с АСЕ2-рецептором, вносит существенный дисбаланс в функционирование этой жизненно важной системы. При этом необходимо учитывать и тот факт, что вирус, проникая в клетки, не только начинает активно размножаться, но и влияет на ответную реакцию клетки на свое вторжение. К настоящему времени уже опубликовано достаточно много обзоров в России и за рубежом, освещающих эти две стороны действия вируса на организм хозяина, однако практически отсутствует анализ тесной взаимосвязи этих двух систем. Поэтому целью данного обзора явился анализ последствий нарушений РАС, вызванных SARS-CoV-2, на состояние элементов врожденного и адаптивного иммунитета, а также оценка возможности прогноза течения заболевания с учетом их изменений.

Физиология РАС и ее связь с иммунной системой организма. В норме РАС обеспечивает поддержание гомеостаза путем регуляции взаимодействия сердечно-сосудистой, дыхательной, системы водно-солевого и углеводного обменов и регуляции кровяного давления [5].

Классическая РАС состоит из двух ветвей, первая из которых включает ангиотензин / ренин / ангиотензин I / ангиотензин-конвертирующий энзим (АСЕ) / ангиотензин II (ANG II) и его рецепторы AT1R и AT2R. Взаимодействие ANG II с AT1R сопровождается повышением кровяного давления, констрикцией сосудов, повышением активности ADAM17 [6], что приводит к появлению циркулирующей формы TNF- α с последующей индукцией провоспалительных цитокинов, усилению пролиферации, инфильтрации и апоптозу [5, 7]. В настоящее время уже установлено, что риском тяжелого течения COVID-19 является не столько сам возраст пациента, сколько так называемые возрастные заболевания, в развитии которых прямо или опосредованно задействована активация 1-й ветви и высокий уровень ANG II [8].

Вторая ветвь РАС открыта относительно недавно и включает ACE2/ANG 1–7/рецептор Mas (Mas R) [9]. Ее функция направлена на подавление гиперактивации 1-й ветви. ANG- (1–7) через взаимодействие с Mas-рецептором вызывает торможение NF-κB-сигнального пути и, как следствие, оказывает противовоспалительное и антиапоптозное действие [10], а также активирует врожденный иммунитет. АСЕ2 является связующим элементом этих двух ветвей РАС и является ключевым ферментом, превращающим ANG II (1-8) – лиганд AT1R в ANG (1–7) с последующей активацией MasR [11]. По-видимому, вирус, вызывая снижение плотности

ACE2-рецепторов, приводит к дисбалансу активности двух ветвей РАС со снижением содержания ANG 1–7 и повышением активности ANG II со всеми вытекающими негативными последствиями, что и лежит в основе более тяжелого течения болезни у людей пожилого возраста с сопутствующими патологиями, для которых характерен исходно сниженный уровень экспрессии рецептора АСЕ2 [12]. Закономерно, что повышение соотношения уровней ACE/ACE2 является предиктором развития острого респираторного дистресс-синдрома, который можно предотвратить применением ANG 1–7 [13]. Однако широкое внедрение ANG 1–7 в клиническую практику ограничено его быстрым разрушением в организме и, возможно, сложностью его доставки в ткань легких и мозга при внутривенном введении. Недавно появились данные, что MasR может активироваться не только ANG 1–7, но и нейропептидом FF, аламан-дином, ангиотензинами III и IV, а также ангиопротек-тином и другими агонистами MasR, разработка которых представляет перспективное направление терапии COVID-19. В настоящее время на разных стадиях клинических испытаний находится более семи соединений, активирующих или усиливающих экспрессию MasR, а также агонистов этого вида рецепторов [14–19]. Из обзора литературы следует, что для лечения COVID-19 и других вирусных инфекций, возбудители которых используют ACE2, для коррекции нарушений РАС предпочтение следует отдавать стойким аналогам ANG 1–7, активирующим MasR.

AT1R локализуется на мембранах многих клеток. Не составляют исключение и клетки, входящие в систему врожденного и адаптивного иммунитетов. На рис. 1 и 2 схематически представлены события, разворачивающиеся при COVID-19 на фоне повышенного уровня ангиотензина II.

В системе врожденного иммунитета наблюдается не только активация дендритных клеток, пролиферация макрофагов и инфильтрация нейтрофилов, но и усиление синтеза провоспалительных цитокинов на фоне повышения чувствительности мембранных Toll-like-рецепторов 2, 4, 7-го и 9-го подтипов, ответственных за узнавание микробных и вирусных патогенов. Сходные события происходят и с клетками адаптивной иммунной системы (см. рис. 2). Лимфоциты T4-helpers через выделение многочисленных провоспалительных цитокинов дополнительно активируют элементы этой системы, что происходит на фоне ослабления тормозного влияния со стороны Т-регуляторных клеток и снижения количества выделяемого противовоспалительного цитокина 10.

Установлено, что вирус SARS-CoV-2 может проникать в мозг и взаимодействовать с АСЕ2-рецеп-торами, локализованными на мембранах астроцитов и микроглии [20], где расположены также и многочисленные рецепторы AT1R и TLRs [21]. На рис. 3 схематично представлены последствия взаимодействия вируса с АСЕ2 и TLR на фоне повышенного

Innate immunity

Chemokines MCP- VCCR2 MCP-2/CCL8

Cytokines

Components of the RAS ACE

Renin secretion

TNFa

IL-10, IL-6, IL-12, IL-15, IL-17, IL-22

Рис. 1. Схема событий при COVID-19: избыток ангиотензина II действует на клетки врожденного иммунитета через рецепторы ATIR и TLR; повышается активность дендритных клеток, увеличивается пролиферация макрофагов и выработка АФК и NF-kB; нейтрофилы, хоть и не имеют прямого рецептора для взаимодействия, приобретают способность к инфильтрации и увеличивают производство NADPH

Рис. 2. Схема событий при COVID-19 с клетками адаптивной иммунной системы:

избыток ангиотензина II активирует CD4-лимфоциты, которые запускают дальнейший каскад реакций; при этом снижается количество регуляторных Т-клеток, осуществляющих тормозное влияние, в результате чего все клетки становятся гиперактивными, и запускается реакция цитокинового шторма

Рис. 3. Схема последствия воздействия вируса COVID-19: накопление ангиотензина II в мозге при блокаде ACE2-рецептора вирусом SARS-CoV-2 действует на рецепторы AT1R и TLR, что приводит к активации провоспалительного пути, выработке активных форм кислорода, синтезу многочисленных провоспалительных цитокинов и гибели нейронов на фоне астроглиоза

уровня ангиотензина II в мозге. Микроглия приобретает провоспалительный фенотип, соответствующий нейровоспалению, увеличивается проницаемость ГЭБ, происходит гибель нейронов и астроглиоз. Макрофаги в сосудистом русле активируются и через выделение активных форм кислорода и провоспалительных цитокинов, что повышает проницаемость ГЭБ и ведет к гибели нейронов, что впоследствии проявляется в виде разнообразных неврологических осложнений после выздоровления.

Важно отметить, что при использовании растворимого внемембранного sACE 2 в качестве лечебного средства для связывания вируса не наблюдалось значительного улучшения состояния у больных COVID-19, что, возможно, объясняется образованием иммунных комплексов «рекомбинантный sACE2+SARS-CoV-2», вызывающих у пациентов аутоиммунный ответ с образованием антител не только против вируса, но и против частей рецепторов ACE и ACE2 с последующим поражением всех органов и тканей, в которых экспрессируются эти рецепторы, с усугублением тяжести заболевания [22].

Механизм нарушения ответной реакции иммунной системы на заражение вирусом SARS-COV-2. На первый взгляд, взаимодействие SARS-CoV-2 мало отличается от такового для других вирусов: вначале связывается c эндосомальными Toll-like-рецепторами 3-го и 7-го типов и цитоплазматическими РНК-рецепторами, затем запускается каскад реакций врожденного иммунитета, происходит активация NF-κB- и IRF-путей, продукция интерферонов, интерлейкина-1 и -6, активируется адаптивный клеточный и, как следствие, гуморальный иммунитет. Однако SARS-CoV-2 запускает воспали- тельный каскад, не давая организму сформировать иммунный ответ, что сопровождается мощным выбросом провоспалительных цитокинов, усугубляет воспалительную реакцию и приводит к массивному повреждению различных тканей иммунными комплексами.

При более детальном анализе этого вопроса можно видеть, что коронавирус проявляет способность к активации синтеза альфа- и гамма-интерфе-ронов в клетке хозяина, а последние могут взаимодействовать с регуляторным сайтом, расположенным в промотере гена Ace2, что приводит к усилению синтеза АСЕ2, тем самым продлевая возможность дальнейшего распространения вируса в зараженном организме [23]. Поэтому перегрузка активированной вирусом интерфероновой системы стимуляторами иммунитета может привести к обратному эффекту – вызвать «цитокиновый шторм» и необходимость использования супрессоров иммунной системы [24], включая антитела к провоспали-тельным цитокинам или их рецепторам, таким как IL-6 и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) или их рецепторам. Предполагаемый механизм, приводящий к развитию «цитокинового шторма», заключается в поэтапном вовлечении ряда внутриклеточных сигнальных путей хозяина. Вошедшая в клетку вирусная РНК узнается эндосомальными РНК-рецепторами хозяина, TLR3 и TLR7, а также цитозольным сенсором РНК, RIG-I/MDA5, что вызывает активацию сигнального каскада NF-κB и IRF3 с транслокацией этих транскрипционных факторов в ядро и стимуляцией экспрессии интерферонов 1-го типа (альфа- и гамма-интерферонов) с последующим их выделением во внеклеточную среду. Интерфероны взаимодействуют с мембранными рецепторами IFNAR и активируют JAK-STAT-систему. Далее происходит фосфорилирование белков STAT1 и STAT2, которые благодаря комплексообразованию с IRF9 проникают в ядро, где стимулируют ряд генов (ISGs), на промоторе которых расположен элемент ISRE, регулирующий силу ответной реакции. Таким образом, коронавирус грубо вмешивается в формирование защитной реакции на этапе синтеза интерферонов и на этапе фосфорилирования СТАТ1. Первоначально задержанная стимуляция ISGs затем реализуется в гиперактивации экспрессии провоспа-лительных цитокинов [24]. Учитывая выраженную гиперреакцию иммунной системы пациентов, зараженных новой инфекцией COVID-19, можно полагать, что особую роль в определении раннего прогноза тяжести течения заболевания играет состояние иммунного статуса пациента.

Осложнения и предикторы тяжелого течения СOVID-19. Клиническая картина у больных новой коронавирусной инфекцией COVID-19 варьируется от легкой до тяжелой, при этом доля последней наряду с числом летальных случаев неуклонно растет по всему миру. В связи с этим возникает острая необходимость в надежных прогностических признаках тяжести течения данного заболевания [25]. На основании анализа обзоров по прогностическим факторам можно сделать вывод о наличии как минимум 49 переменных, представляющих ценную прогностическую информацию о смертности или тяжелом течении заболевания у пациентов с COVID-19. Выявленные переменные включают социально-демографические признаки, анамнестические данные о сопутствующих заболеваниях, результаты физикального осмотра, лабораторные и рентгенологические данные. Выбор наиболее информативных факторов уже на раннем этапе необходим для определения эффективной тактики лечения [26].

Наиболее ранними предикторами ухудшения состояния больных при COVID-19 являются повышенные значения IL-6, IL-10 и С-реактивного белка (CRP), а также снижение количества лимфоцитов [27]. Так, установлено, что при двусторонней пневмонии у 3–4 % пациентов отмечается развитие острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который у 3/4 таких больных сопровождается тромботической коагулопатией, в терминальных стадиях приводящей к тромбозам и «цитокиновому шторму», вызываемому системным выделением провоспалительных цитокинов: интерлейкинов IL-2, IL-6, IL-7, гранулоцит колоние-стимулирующего фактора, C-X-C motif хемокина 10 (CXCL10), хе-мокина (C-C motif) лиганда 2 (CCL2) и фактора некроза опухолей альфа (TNF- α ), при этом отмечается лейкопения, свидетельствующая о сниженном клеточном иммунитете [28].

В настоящее время уже не вызывает сомнения существование неразрывной внутренней связи между иммунитетом и секрецией цитокинов, высокие уровни которых на фоне низкого количества субпопуляций лимфоцитов были связаны с повышенным риском смерти от COVID-19. Была создана модель прогнозирования на основе IL-8 и количества CD4+ T-клеток и NK-клеток, показавшая хорошие результаты в прогнозировании смерти пациентов с COVID-19. При использовании порога 0,075 чувствительность и специфичность модели прогнозирования составляли 90,20 и 90,26 % соответственно. Среди всех переменных нейтрофилы, IL-6, CD3, -CD56, CD16-клетки и лейкоциты были четырьмя наиболее влиятельными факторами в тяжелых случаях, тогда как в легких случаях первыми пятью переменными были CD, CD56, CD16+ клетки, PD-1+ NK-клетки, NK-клетки, CD4+/CD8+и перфорин. Вместе с тем нейтрофилы внесли наибольший вклад в эту модель, что согласуется с более сильным воспалительным ответом у тяжелых пациентов с COVID-19. Кроме того, для определения хода развития болезни была продемонстрирована полезность измерения подмножеств NK-клеток на ранней стадии госпитализации [29]. Динамический мониторинг цитокинов и субпопуляций лимфоцитов дает потенциальную ценность для управления процессом болезни. Крупные метаанализы выявили отрицательную корреляцию между падением клеточного иммунитета и увеличением уровня провоспалительных цитокинов для прогнозирования перехода от легкой степени течения заболевания к тяжелой [28], при этом в периферической крови происходит значительное уменьшение лимфоцитов, моноцитов, CD4+T-клеток, CD8+ T-клеток, CD3-клеток, клеток CD19 и естественных киллеров (NK), а также увеличение интерлейкина-2 (IL-2), IL-2R, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α и интер-ферона-гамма (INF-γ) [30]. Увеличение концентрации в крови плазмина и плазминогена также является биомаркером повышенной восприимчивости к SARS-CoV-2, поскольку протеаза плазмин может разрезать соответствующий сайт S-белка SARS-CoV-2, что повышает его вирулентность [31]. Мощным прогностическим фактором развития тяжелой формы COVID-19 является рост отношения нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) и нейтрофилов к CD8 + Т-клеткам (N8R) [32].

Как уже указывалось, одним из ключевых признаков тяжелого течения заболевания при COVID-19 является патологическая гиперактивация иммунитета, где центральная роль отведена активации нейтрофилов. Протеомное профилирование плазмы поперечных и продольных когорт госпитализированных пациентов с COVID-19 выявило характерные признаки активации нейтрофилов, включая резистин, липокалин-2, фактор роста гепатоцитов, интерлейкин-8 и фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, которые были самыми сильными предикторами критического течения заболевания. Важным открытием стал факт, что сигнатура активации нейтрофилов была повышена уже в первый день госпитализации у тех пациентов, у которых впоследствии состояние ухудшилось до критического и требовало перевода в отделение интенсивной терапии. Исследователями было выдвинуто предположение, что высокие уровни G-CSF стимулируют экстренный гранулопоэз для увеличения продукции нейтрофилов, а IL-8 (CXCL8) управляет миграцией нейтрофилов в легкие и, возможно, другие ткани. Там нейтрофилы активируются и высвобождают RETN, LCN2, HGF, MMP8 и другие белки с антимикробными и другими воспалительными функциями, которые также вызывают значительные побочные повреждения легких, сосудистой сети и других органов [33]. Известно, что NK-клетки и Т-клетки играют жизненно важную роль в противовирусном иммунитете. Исследования больных с COVID-19 показали, что количество и частота CD4+Т-клеток, CD8+Т-клеток и NK T-клеток в тяжелых случаях были значительно ниже, чем в легких случаях. Значительно повышенные уровни экспрессии PD-1 и CD244 на CD8+Т-клетках указывают на истощение Т-клеток у пациентов с COVID-19 и на снижение экспрессии CD27 на CD8+Т-лимфоцитах в тяжелых случаях по сравнению с легким течением заболевания. Поэтому в качестве предиктора риска для выявления «тяжелых» пациентов эффективно использовать характеристики иммунных клеток и цитокинов.

Прогнозирование риска развития тяжелого состояния – чрезвычайно важная задача, поскольку может помочь в принятии решений об объеме необходимой медицинской помощи и стратегиях последующего лечения. Текущие исследования в этом направлении сосредоточены на ряде предикторов среди клинических и лабораторных данных (модели 4C Deterioration и 4C Mortality Score). Однако важно отметить, что ковариация между прогнозами 4C Deterioration и 4C Mortality не различалась по полу или этнической принадлежности, но ослаблялась у молодых возрастных групп [34]. Коллектив зарубежных ученых из Университета штата Аризона, Гарвардского университета и Национального центра биотехнологической информации (США) разработали математическую модель, позволяющую оценивать вероятность развития цитокинового шторма при COVID-19 в зависимости от интенсивности стимуляции выработки цитокинов иммунными клетками с использованием многочисленных параметров. К сожалению, о возможности развития острого респираторного дистресс-синдрома в ряде мест судят по более простым параметрам, таким как появление высокой температуры, уровню С-белка, снижению числа лимфоцитов, прогрессированию поражения легких, снижению сатурации. Данные исследований показывают, что в процессе оценки тяжести состояния и прогнозирования летального исхода должно учитываться влияние иммуногенетики пациента, а именно гендерных иммуногенетических различий. Так, в настоящее время уже доказано участие локуса AB0, генов HLA, регулирующих экспрессию последова- тельностей ДНК, кодирующих цитокины и хемокины [35]. Также было установлено, что пожилые люди мужского пола являются группой повышенного риска тяжелого течения заболевания, развития пневмонии с респираторным дистресс-синдромом и смерти. Возраст является ключевым фактором заболеваемости и смертности от COVID-19, поэтому понимание связанных с возрастом иммунных характеристик пациентов и состояния обеих ветвей РАС с анализом соотношения АСЕ/АСЕ2 важно для определения профилактических и терапевтических стратегий. Так, на основании исследования был выявлен ведущий характерный возрастной иммунный признак, связанный с тяжестью заболевания, а именно определены циркулирующие факторы – CXCL8, IL-10, IL-15, IL-27 и TNF-α – положительно коррелирующие с пожилым возрастом, более длительной госпитализацией и более тяжелой формой заболевания [36].

Выводы. Анализ многочисленных публикаций, посвященных различным нарушениям в функционировании РАС и иммунной системы при COVID-19, позволил прийти к заключению о существовании тесной взаимосвязи между этими системами. Связующим элементом является рецептор АСЕ2, играющий основную роль в интернализации вируса в клетку. Повышение уровня ангиотензина II в результате блокады АСЕ2-рецептора и взаимодействие с АТ1R-рецепторами, локализованными на ряде клеточных элементов врожденного и приобретенного иммунитетов, приводит к гиперактивации последних, что сопровождается синтезом и мощным выбросом во внеклеточное пространство большого количества разнообразных провоспали-тельных хемо- и цитокинов, что представляет угрозу развития цитокинового шторма. По-видимому, особенностью SARS-CoV-2 является его способность запускать воспалительный каскад до формирования защитного иммунного ответа из-за задержки синтеза интерферонов. Анализ литературы по предикторам тяжелого течения болезни позволил прийти к однозначному выводу, что величина соотношения уровней АСЕ/АСЕ2 и иммунный статус больного даже на начальных стадиях заболевания позволяют оценить риск тяжелого течения. Самое пристальное внимание следует уделять изменению состояния нейтрофилов. Таким образом, анализ представленных в обзоре материалов имеет значение не только для фундаментальной медицины, но и содержит данные для практической оценки прогноза течения заболевания и выбора оптимальной тактики лечения.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ (Проект № 18-15-00392).