Иммунобиологическая оценка кандидатного вакцинного штамма МК-200 вируса африканской чумы свиней

Африканская чума свиней (АЧС, возбудитель — вирус африканской чумы свиней, African swine fever virus , ASFV, сем. Asfarviridae , род Asfivirus ) — смертельная геморрагическая вирусная инфекция свиней и евразийских диких кабанов ( Sus scrofa ), которая в традиционном субсахарном нозоареале эволюционирует в сильватическом цикле между бородавочниками ( Phaco-choerus africanus ) и аргазидными клещами ( Ornithodoros moubata) . Вирус африканской чумы свиней характеризуется значительной изменчивостью иммунобиологических и генетических свойств.

При острой форме инфекции 100 % животных погибают в течение 5-10 сут после начала проявления клинических признаков заболевания (1, 2). Занос восточноафриканского вируса АЧС генотипа II на Кавказ в 2007 году привел к тому, что заболевание получило широкое распространение в Восточной и Центральной Европе, а с 2018 года — в Китае и многих других странах Азии (3, 4). Глобальная эпизоотия АЧС стимулировала исследования по получению и изучению свойств кандидатных вакцинных штаммов, в первую очередь рекомбинантных и аттенуированных, рассматриваемых в качестве основы вакцин первого поколения. Однако из-за отсутствия международно признанных протоколов (стандартов) для лабораторной оценки вакцинных штаммов и вакцин против АЧС имеет место вариативность экспериментальных подходов, применяемых научными группами, что затрудняет интерпретацию и сравнение результатов испытаний (5). Это создает проблемы для компетентных органов и учреждений, ответственных за выдачу разрешений на производственные испытания и применение вакцин.

Исходными следует считать требования к вакцинным штаммам вируса АЧС и вакцинным препаратам на их основе, разработанные в 1980-х годах специалистами ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (ныне ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии) и Главного управления ветеринарии МСХ СССР. Вакцинные штаммы должны были быть слабо или умеренно реактогенными, не реверсибельными, обусловливать ограниченную по срокам виремию, не вызывать осложнений аллергической или аутоиммунной природы, не передаваться интактным свиньям при их совместном содержании с привитыми. Вакцинные препараты, изготовленные на основе аттенуированных штаммов, должны были быть безвредными для свиней в 5-10-кратной прививочной дозе и обеспечивать формирование защиты на 7-14-е сут после прививки против референсного вирулентного штамма гомологичного сероиммунотипа не менее чем у 75 % животных продолжительностью не менее 4 мес (6).

В 2021 году Всемирная организация по охране здоровья животных (World Organisation for Animal Health, WOAH) инициировала работу по достижению консенсуса относительно методов и критериев оценки кандидат-ных вакцин первого поколения (живых) против АЧС. Дискуссии ведутся по определению критериев гомологичности и гетерологичности изолятов/штам-мов вируса АЧС (7-9), подбору экспериментальных животных (10-12), способам (13) и кратности вакцинации (14), дозам вакцинного (15) и вирулентного (14, 16) штаммов, оценке клинических (17, 18) и патологоанатомических (19-21) признаков, периодам наблюдения после вакцинации и контрольного заражения, методам оценки (22-24) и предельным уровням виремии (25), выделению вируса после вакцинации и контрольного заражения (26-28), сероконверсии (29) и протективности (22), реверсии (30) и трансмиссии вируса (31-33), полевым стандартам эффективности (13, 33, 34).

Солидарное понимание перечисленных и других критериев может быть сформировано в результате всестороннего теоретического анализа и детального экспериментального обоснования.

В большинстве работ сроки изучения виремии и вирусовыделения после введения животным кандидатных вакцинных штаммов и контрольного заражения составляют соответственно 21-28 и 14-28 сут (16, 25, 34). В результате сведения об их иммунобиологических свойствах ограничены кратким периодом испытаний, что позднее может привести к проблемам при регистрации вакцин и, как следствие, необходимости проведения дополнительных длительных экспериментов. Поскольку четкой грани между поствакцинальными реакциями и бессимптомной/хронической формами АЧС нет, сведения о них можно рассматривать симультанно (39).

У свиней, инокулированных умеренно вирулентным штаммом Neth-erlands’86, в образцах крови выживших (2/3) животных вирусный геном выявляли методом ПЦР-РВ до 91-х сут (срок наблюдения) (28). Обращает на себя внимание тот факт, что у свиней, привитых первым коммерческим вакцинным штаммом ASFV-G-ΔI177L (как его называют авторы вакцины), уровни виремии на 28-е сут составляли от 10^2,0 до 10^6,6 ГАЕ 50 /мл (22, 30). Наличие виремии через 28-35 сут после инъекции может быть следствием недостаточно индуцированной иммунологической защиты и служить причиной последующей горизонтальной и/или вертикальной передачи вакцинного штамма соответственно интактным животным или плодам (6). Поэтому целесообразно исследовать не только виремию, но и присутствие кан-дидатного вакцинного штамма в ротовой полости у привитых особей.

В настоящем исследовании впервые выявлены два цикла репликации вирусной ДНК в организме свиней, инокулированных кандидатным вакцинным штаммом МК-200 вируса АЧС: первый — на 17-21-е сут, второй — на 56-70-е сут после введения вируса.

Цель работы — иммунобиологическая оценка кандидатного вакцинного штамма МК-200 вируса африканской чумы свиней по результатам наблюдения за клиническим состоянием животных, по содержанию вирусоспецифической ДНК и вирусоспецифических антител в биоматериале.

Методика. Работу проводили в 2022 году в Федеральном исследовательском центре вирусологии и микробиологии (ФГБНУ ФИЦВиМ). Использовали 10 клинически здоровых свиней ( Sus domesticus ) породы крупная белая 2-3-месячного возраста, полученных из отдела подготовки подопытных животных ФГБНУ ФИЦВиМ. Животных размещали в индивидуальных станках. Условия содержания и эвтаназии свиней соответствовали протоколу Guide for the Care and Use of laboratory Animals, AVMA Guidelines (35).

Вирулентные штаммы вируса АЧС — Мозамбик-78 (III сероиммуно-тип, V генотип) и Ставрополь 01/08 (VIII сероиммунотип, II генотип) и аттенуированный штамм МК-200, полученный посредством селекции из штамма Мозамбик-78, с инфекционными титрами 10^7,0-10^8,0 ГАЕ 50 /мл были взяты из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ.

Приготовление первичной культуры клеток лейкоцитов свиней (ЛС) осуществляли в соответствии с ГОСТ 28573-90 (36). Инфекционные титры вируса АЧС штаммов Мозамбик-78 и Ставрополь 01/08 определяли в культуре клеток ЛС в реакции гемадсобции и рассчитывали по методу Б.А. Кербера в модификации И.П. Ашмарина (37, 38).

Схема эксперимента включала внутримышечную инокуляцию вируса АЧС (штамм МК-200) в дозе 106,0 ГАЕ50 10 свиньям на 0-е сут. Образцы для исследования отбирали на 0-е, 3-и, 5-е, 7-е, 14-е, 17-е, 21-е, 28-е, 35-е, 42-е, 49-е, 56-е, 63-и, 70-е, 77-е сут после инъекции (с.п.и.). Температуру тела измеряли ректально в течение всего срока наблюдения.

После эвтаназии проводили общее патологоанатомическое исследование селезенки, легких, миндалин, почек и по меньшей мере трех различных лимфатических узлов (включая лимфатический узел, ближайший к месту прививки, желудочно-печеночные и подчелюстные узлы).

Образцы крови получали пункцией яремной вены. Набирали 10 мл крови в пробирку с антикоагулянтом и 10 мл — в пробирку с активатором свертывания крови. Для получения образцов слюны свиней время для жевания прядей веревки (ООО «ТД ПРОМТ», Россия) ограничивали 30 мин. Мокрые пряди веревок отжимали в чистые полиэтиленовые пакеты (ООО «ТД ПРОМТ», Россия) и переливали собранную слюну в центрифужные пробирки («Thermo Fisher Scientific», США). Мазки с внутренней стороны щеки получали с помощью стерильного полиэфирного зонда-тампона с пластиковым аппликатором («МиниМед», Россия). Далее зонд-тампон помещали в 2 мл стерильного фосфатного буферного раствора с рН 7,2 (ФБР) и перемешивали в течение 1 мин. Образцы центрифугировали при 2000 g в течение 2 мин (Eppendorf Mini Spin, «Eppendorf AG», Германия). Полученные надосадочные жидкости сывороток крови, слюны, мазков с внутренней стороны щеки и образцы крови аликвотировали в 1-2 мл криопробирки («Thermo Fisher Scientific», США), на которые наклеивали этикетки с указанием индивидуального номера животного, даты отбора и типа образца. Пробы хранили при - 40 ° С до проведения исследований.

Для выделения нуклеиновых кислот использовали систему ДНК MagMAX™ Pathogen RNA/DNA Kit («Thermo Fisher Scientific», США). ПЦР-РВ проводили с использованием тест-системы IDEXX RealPCR ASFV DNA Mix («IDEXX», США) на приборе CFX96 Touch™ («Bio-Rad», США) с программным обеспечением Bio-Rad CFX Manager.

Для обнаружения антител к белкам вируса АЧС в сыворотке крови свиней применяли тест-систему ID Screen® African Swine Fever Competition («IDVet», Франция) с использованием термошейкера для иммунопланшета BioSan PST-60HL («BioSan», Латвия) и иммунохимического анализатора Sunrise («Tecan Austria GmbH», Австрия). Согласно инструкции изготовителя, для каждого образца по оптической плотности (ОП) рассчитывали S/N %, где S = ОП образец — ОП положительный контроль ; N = ОП отрицательный контроль - ОП положительный контроль , и вычисляли показатель вирусоспецифических антител (100 — S/N) %, значение которого было тем выше, чем больше вирусоспецифических антител содержалось в образце.

Результаты обрабатывали в программе Microsoft Excel 2016. Данные представлены в виде средних арифметических значений ( M ) и стандартных ошибок среднего (±SEM). Сравнение между группами данных проводили с использованием t -критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты. Мы провели эксперименты по сопоставлению результатов ПЦР-РВ (значения Ct) и инфекционных титров (ГАЕ 50 /мл) в 10-кратных разведениях вирусосодержащих суспензий, полученных посредством заражения культуры клеток ЛС вирусом АЧС штаммов Мозамбик-78 или Ставрополь 01/08 (рис. 1). Установлена линейная зависимость между инфекционными титрами и показателями Ct. Это позволило переводить данные, полученные при исследовании проб крови и образцов из ротовой полости в ПЦР-РВ, в значения инфекционных титров. Например, показаниям Ct 30, 35, 40 соответствовали значения инфекционных титров вируса АЧС 10^4,1, 10^3,3, 10^1,9 ГАЕ 50 /мл.

Рис. 1. Зависимость между показателями, полученными в ПЦР-РВ (Ct) , и инфекционными титрами (lg ГАЕ 50 /мл) в культуре клеток лейкоцитов свиней ( Sus domesticus ) породы крупная белая, инфицированных штаммами Ставрополь 01/08 (1) или Мозамбик-78 (2) вируса африканской чумы свиней (ФГБНУ ФИЦВиМ, 2022 год) .

Рис. 2. Абсолютные значения Ct, полученные при исследовании в реакции ПЦР-РВ проб крови (А) , слюны (Б) и мазков с внутренней стороны щеки (В) , отобранных у свиней ( Sus domesticus )

породы крупная белая, которые были внутримышечно инокулированы штаммом МК-200 вируса африканской чумы свиней в дозе 10^6,0 ГАЕ 50 , в зависимости от времени после инокуляции .

Справа — номера свиней с 1 по 10 (ФГБНУ ФИЦВиМ, 2022 год) .

Из 10 животных, которым инокулировали штамм МК-200, только у трех было зарегистрировано кратковременное (на 1-2 сут), незначительное повышение температуры тела выше физиологической нормы (40,1-40,6 °С) в период с 5-х по 7-е с.п.и. У остальных животных на протяжении первых 10 сут температура тела соответствовала показателям физиологической нормы. В период с 8-х по 77-е с.п.и. у всех свиней клинические признаки АЧС отсутствовали. По окончании эксперимента у всех животных не было выявлено характерных для АЧС патологоанатомических изменений.

При исследовании проб крови первые положительные результаты по выявлению генома вируса АЧС методом ПЦР-РВ были отмечены на 5-е с.п.и. у 70 % животных (Ct min — 37,8, max — 32,4). В период с 7-х до 21-е с.п.и. у 90-100 % свиней пробы крови были положительными (40,328,6), с 28-х до 42-е с.п.и. — у 50-70 % (40,3-32,1), с 49-х по 56-е с.п.и. — у 20 % (40,2-36,3), на 63-и с.п.и. — у 70 % (41,0-36,6), с 70-х по 77-е с.п.и. — у 10-20 % (39,5-38,4) (рис. 2, А). В период с 5-х до 63-х с.п.и. расчетная виремия была в пределах от 10^4,0 ГАЕ 50 /мл до 10^2,0 ГАЕ 50 /мл, а с 70-х с.п.и. у 80-90 % животных виремия оказалась ниже 101,9 ГАЕ50/мл или отсутствовала.

В образцах слюны (см. рис. 2, Б) первые положительные пробы были отмечены с 3-х с.п.и. у 40 % (42,0-39,0) животных, в период с 7-х до 21-х с.п.и. — у 50-60 % (41,9-32,4), на 28-е с.п.и. — у 30 % (39,7-35,8), на 35-е с.п.и. — у 10 % (35,6). С 42-х по 49-е с.п.и. ДНК вируса АЧС в образцах слюны не выявляли. В период с 56-х до 77-х с.п.и. положительными были пробы у 30-50 % (39,7-36,1) свиней, что больше, чем в пробах крови. В пробах слюны положительные показания Ct были в пределах 32,4-42,0, что соответствует инфекционности вируса АЧС от 10^3,8 до 10^1,0 ГАЕ 50 /мл.

В мазках с внутренней стороны щеки (см. рис. 2, В) положительные пробы выявляли с 3-х по 14-е с.п.и. у 10-40 % животных (40,9-34,9), на 1721-е с.п.и. — у 40-60 % (39,9-33,2), на 28-35 с.п.и. — у 20 % (38,9-31,4). На 42-е с.п.и. все пробы были отрицательными, на 49-56-е с.п.и. положительные пробы были выявлены у 20-30% животных (40,4-38,3), на 63-70 с.п.и. — у 40 % (40,9-37,3), на 77-е с.п.и. — у 10 % (36,8). В пробах мазков с внутренней стороны щеки показания Ct находились в пределах 31,4-40,9, что соответствовало инфекционным титрам вируса АЧС от 10^3,8 до 10^1,9 ГАЕ 50 /мл.

Результаты статистического анализа наших данных подтвердили наличие двух пиков репродукции вируса АЧС (рис. 3). Средние значения минимальных и максимальных показателей Ct в основаниях и вершинах первого (17-21 с.п.и.) и второго (63 с.п.и.) пиков статистически значимо различались ( n = 10, р < 0,05).

На 7-е с.п.и показатели вирусоспецифических антител у 9 из 10 свиней были в диапазоне от 1 до 59 %, на 14-е с.п.и. — от 58 до 90 %. К 28-м с.п.и. они достигали максимальных значений 95-100 % и оставались на постоянном уровне до окончания эксперимента (данные не приведены). Только у животного ¹ 8 диагностически отрицательные (менее 60 %) значения показателей вирусоспецифических антител регистрировали с 0-х до 49-х с.п.и. С 56-х по 77-е с.п.и. они были диагностически положительными (достигали 100 %). Вероятно, это было связано с индивидуальными особенностями иммунной системы.

В зависимости от свойств изолятов/штаммов и способов инокуляции выделение вируса АЧС с секретами и экскретами начинается через 1-7 с.п.и.

(39-41). В нашем эксперименте в крови и образцах из ротовой полости свиней ДНК вируса АЧС штамма МК-200 начинали выявлять на 3-и–5-е с.п.и. Незначительный подъем температуры тела у 30 % животных происходил на 2 сут позже.

Рис. 3. Средние значения Ct ( n = 10, M ±SEM) , полученные при исследовании в реакции ПЦР-РВ проб крови (А) , слюны (Б) , мазков с внутренней стороны щеки (В) у свиней ( Sus domesticus ) породы крупная белая, которые были внутримышечно инокулированы штаммом МК-200 вируса африканской чумы свиней в дозе 10^6,0 ГАЕ 50 , в зависимости от времени, прошедшего после инокуляции (ФГБНУ ФИЦВиМ, 2022 год) .

Минимальные показатели (максимальное количество исследуемой матрицы) порогового цикла при постановке ПЦР-РВ, полученные при исследовании проб крови, слюны, мазков с внутренней стороны щеки, были установлены в период с 17-21-х с.п.и., доля положительных проб достигала 60-100 %. С 28-х по 49-е с.п.и. отмечали снижение с 20-30 % до 0 % доли положительных проб слюны и мазков с внутренней стороны щеки. С 56-х по 70-е с.п.и. в пробах слюны и мазках с внутренней стороны щеки наблюдался второй пик доли положительных проб — от 30 до 40 %. В пробах крови второй пик был зарегистрирован на 63-е с.п.и. — 70 %.

Наши результаты по срокам обнаружения вирусной ДНК в исследованных образцах и наличию двух пиков репликации штамма МК-200 вируса АЧС в организме свиней близки к сведениям, опубликованным H.C. de Carvalho Ferreira с соавт. (42). Было показано, что у большинства свиней, выживших после внутримышечного или интраназального введения умеренно вирулентных изолятов Malta’78 и Netherlands’86 вируса АЧС, пробы крови и образцы из ротовой полости оставались положительными в ПЦР-РВ в течение, как минимум, 70 сут. Уровень обнаружения вирусной ДНК в ротовой полости был максимальным во время фазы проявления клинических признаков АЧС, второй пик экскреции, по данным ПЦР-РВ, приходился на 55-70-е с.п.и. Последний связывали с репликацией вируса в миндалинах или лимфатических узлах (43). Авторы пришли к заключению, что персистентно инфицированные животные могут выделять вирус АЧС из ротовой полости и передавать его восприимчивым свиньям при прямом или непрямом контактах (42). Это было подтверждено результатами испытаний вакцины против АЧС из штамма ASFV-G-ΔI177, названной ее авторами «первой коммерческой». Методом ПЦР-РВ установлена контактная передача вакцинного вируса 30 % нативных животных, содержащихся совместно с вакцинированными. В сыворотках крови 50 % нативных свиней выявлены вирусоспецифические антитела, что однозначно свидетельствует о передаче вакцинного вируса (30).

В период с 0-х до 63-х с.п.и. значения виремии в нашем опыте не превышали 10^4,0 ГАЕ 50 /мл и с 70-х с.п.и. были ниже 10^1,9 ГАЕ 50 /мл. Тем не менее у некоторых животных виремия могла продолжаться до 77 с.п.и. Об аналогичных результатах сообщали французские исследователи (44), которые из вирулентного штамма Georgia 2007/1 получили аттенуированный кандидатный вакцинный штамм ASFV-989. Его внутримышечное или оро-назальное введение защищало 100 % свиней от заражения родительским штаммом через 28 сут. По результатам оценки геномной нагрузки методом ПЦР-РВ были рассчитаны уровни виремии штамма ASFV-989: на 5-е с.п.и. — 10^5,9 ГАЕ 50 /мл, на 35-е — 10^4,5 ГАЕ 50 /мл, на 56-е с.п.и. — 10^3,5 ГАЕ 50 /мл, на 70-е —10^2,0 ГАЕ 50 /мл, на 100-е — 10^0,7 ГАЕ 50 /мл (44).

Показания Ct в ПЦР-РВ в исследованных нами пробах из ротовой полости на 70-77-е с.п.и. оказались сопоставимы с таковыми в пробах крови. Репродукция вируса может происходить в лимфоузлах и железах, расположенных рядом с ротовой полостью. Недавно было показано, что через 2 мес после введения свиньям рекомбинантного аттенуированного штамма ASFV-GZΔI177LΔCD2vΔMGF вирусную ДНК выявляли в околоушной слюнной железе и в меньшей концентрации (в 1,5 раза) — в паховых лимфоузлах (33).

Таким образом, у свиней породы крупная белая, инокулированных кандидатным вакцинным штаммом МК-200 вируса африканской чумы свиней (АЧС), в течение 2,5 мес наблюдалась цикличная виремия и формировалась возможность для вирусовыделения через ротовую полость. Это указывает на риски вертикальной и горизонтальной передачи кандидатного вакцинного штамма восприимчивым свиньям при прямом или непрямом контакте. Однако, учитывая тот факт, что количество и частота выделения 794

вируса, наблюдаемые после 35-х с.п.и., сравнительно меньше, риски передачи в этот период будут ниже, чем в первые 35 с.п.и. Разработчикам кан-дидатных живых вакцин против АЧС целесообразно рекомендовать предоставлять данные об исследовании виремии и вирусовыделения (пробы слюны) за период от 2,5 до 4 мес после прививки. Обобщение результатов наших наблюдений за клиническим состоянием животных, определения вирусной ДНК в крови и пробах из ротовой полости дает основание считать, что инфекция, вызванная штаммом МК-200 вируса АЧС, протекала в бессимптомной (70 %) или хронической (30 %) формах.