Ветеринарная вирусология, микробиология, иммунология. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Резюме: Salmonella Pullorum - редко встречающийся, но важный патоген из рода Salmonella , который наносит серьезный вред птицеводству и вызывает экономические потери, связанные с высокой летальностью птицы. Терапия бактериофагами активно обсуждается в последнее время как дополнительный метод лечения птицы. В представленной работе была впервые показана терапевтическая эффективность вирулентного бактериофага Salmonella phage BF-1356, назначенного спустя 12 ч после перорального заражения цыплят кросса Cobb 500 высоковирулентным штаммом Salmonella Pullorum № 732-ВИЭВ. Цель работы - характеристика бактериофага Salmonella phage BF-1356 и его взаимодействия с бактериальным штаммом-хозяином in vitro, а также оценки эффективности фаготерапии пуллороза in vivo на модели цыплят Cobb 500. Штамм сальмонеллы (Salmonella Pullorum № 732-ВИЭВ) был выделен в 2017 году на птицефабрике в Московской области. Для проведения фаготерапии использовали вирулентный бактериофаг Salmonella phage BF-1356 из коллекции Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (Россия). Очищенный бактериофаг содержал титр не менее 1011 БОЕ/мл. Стерильность готового фага проверяли посредством инкубации 0,1 мл фаголизата в 5 мл тиогликолевой среды («HiMedia», Индия) при 32,5±2,5 и 22,5±2,5 °С в течение 14 сут. Диапазон литической активности бактериофага определяли в отношении 164 бактериальных штаммов Salmonella enterica , выделенных на территории РФ в 2010-2018 годы. Литическую активность оценивали визуально по появлению зоны лизиса в точках нанесения бактериофага на индикаторные чашки Петри с 1,5 % агаром Мюллера-Хинтона, которые содержали 200 мкл культуры исследуемых штаммов в середине лог-фазы (106 КОЕ). Оценивали адсорбцию бактериофага Salmonella phage BF-1356 на штамме Salmonella Typhimurium B-1025. Латентный период и выход Salmonella phage BF-1356 определяли посредством мониторинга динамических изменений числа фаговых частиц в течение репликативного цикла на штамме Salmonella Typhimurium B-1025. Чтобы оценить влияние pH на титр бактериофагов, известные концентрации очищенных бактериофагов инкубировали в буферах при различных значениях pH. В качестве лабораторных объектов использовали не зараженных сальмонеллами 14-суточных цыплят (Gallus gallus L.) кросса Cobb 500 (n = 40). Цыплят случайным образом разделили на группы: 10 цыплят использовали для контроля условий содержания (I контрольная группа не подвергалась заражению и фаготерапии), 20 цыплят - для определения эффективности препарата после его лечебного использования и оценки дальнейшего сальмонеллоносительства (опытная группа); 10 цыплят - как контроль заражения (II контрольная группа, инфицированная сальмонеллой, без введения бактериофага). Птицу опытной и II контрольной группы в возрасте 14 сут подвергали пероральному заражению Salmonella Рullorum № 732-ВИЭВ в дозе 3,8½108 кл., в объеме, равном 0,4 мл, что соответствовало ~ 5 LD50 (острой инфицирующей дозе, гарантирующей моделирование инфекции пуллороза с полной гибелью в контрольной группе). Критерием для начала применения бактериофага служило появление симптомов инфекционного процесса. Цыплятам из опытной группы вводили бактериофаг перорально в дозе 1010 БОЕ/мл, в объеме 0,2 мл. Исследование на наличие фагов и сальмонелл у птицы проводили сразу после дефекации. Число фаговых частиц оценивали методом двойных агаровых слоев. Для подтверждения эффективности фаготерапии птицу из опытной группы подвергали убою, проводили патологоанатомическое вскрытие и отбор секционного материала для лабораторных исследований и идентификации культур сальмонелл из органов. В контрольной группе патологоанатомическое вскрытие проводили по мере падежа птицы. Бактериофаг Salmonella phage BF-1356 проявлял специфическую литическую активность в отношении распространенных сероваров сальмонелл, таких как Pullorum, Enteritidis, Typhimurium, Cholerasuis, Infantis. Латентный период для бактериофага составлял в среднем 40 мин, а среднее число высвободившихся фагов из одной клетки-мишени - 67 вирусных частиц. Бактериофаг был стабилен при pH 5-8 и незначительно снижался в титре при pH 3,6 в течение 1 ч. Однократное пероральное введение бактериофага BF-1356 в титре 1010 БОЕ/мл через 12 ч после заражения цыплят кросса Cobb 500 штаммом Salmonella Pullorum № 732 позволило обеспечить 100 % сохранность поголовья и значительно снизить последствия патологического процесса у цыплят. Гибель цыплят контрольной группы происходила в течении 2-6 сут. Структура поражений была свойственна для сальмонеллезной патологии, что подтвердилось в лабораторных условиях. Полной элиминации возбудителя из организма не было достигнуто, однако при инфицировании 5 LD50 отмечали эффективное снижение выделения возбудителя из органов и тканей уже на 7-е сут.
Бесплатно
Иммунобиологическая оценка кандидатного вакцинного штамма МК-200 вируса африканской чумы свиней
Статья научная
Африканская чума свиней (АЧС, возбудитель - вирус африканской чумы свиней, African swine fever virus, ASFV, Asfarviridae, Asfivirus) - смертельная геморрагическая вирусная инфекция домашних свиней и евразийских диких кабанов (Sus scrofa). В зависимости от свойств изолятов/штаммов течение болезни может быть сверхострым, острым, подострым, хроническим и бессимптомным. Глобальная эпизоотия АЧС стимулировала работы по получению и изучению свойств кандидатных вакцинных штаммов, в первую очередь рекомбинантных и аттенуированных, рассматриваемых в качестве основы вакцин первого поколения. В настоящем исследовании впервые выявлены два цикла репликации вирусной ДНК в организме свиней, инокулированных кандидатным вакцинным штаммом МК-200 вируса АЧС: первый - на 17-21-е сут, второй - на 56-70-е сут после введения вируса. Цель работы - иммунобиологическая оценка кандидатного вакцинного штамма МК-200 вируса африканской чумы свиней по результатам наблюдения за клиническим состоянием животных, по содержанию вирусоспецифической ДНК и вирусоспецифических антител в пробах, полученных от свиней. Работу проводили в 2022 году в Федеральном исследовательском центре вирусологии и микробиологии (ФГБНУ ФИЦВиМ). Использовали клинически здоровых свиней ( Sus domesticus ) породы крупная белая 2-3-месячного возраста. Вирулентные штаммы вируса АЧС - Мозамбик-78 (III сероиммунотип, V генотип) и Ставрополь 01/08 (VIII сероиммунотип, II генотип) и аттенуированный штамм МК-200, полученный посредством селекции из штамма Мозамбик-78, с инфекционными титрами 107,0-108,0 ГАЕ50/мл были получены в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ. Приготовление первичной культуры клеток лейкоцитов свиней (ЛС) осуществляли в соответствии с ГОСТ 28573-90. Инфекционные титры вируса АЧС определяли в культуре клеток ЛС в реакции гемадсобции и рассчитывали по методу Б.А. Кербера в модификации И.П. Ашмарина. Схема эксперимента включала внутримышечную инокуляцию 10 свиньям вируса АЧС (штамм МК-200) в дозе 106,0 ГАЕ50 на 0-е сут. Образцы для исследования отбирали на 0-е, 3-и, 5-е, 7-е, 14-е, 17-е, 21-е, 28-е, 35-е, 42-е, 49-е, 56-е, 63-и, 70-е, 77-е сут после инъекции (с.п.и.). Температуру тела у экспериментальных животных измеряли ректально в течение всего срока наблюдения. Образцы крови получали пункцией яремной вены. Для получения образцов слюны свиней время для жевания прядей веревки (ООО «ТД ПРОМТ», Россия) ограничивали 30 мин. Мокрые пряди веревок отжимали в чистые полиэтиленовые пакеты (ООО «ТД ПРОМТ», Россия) и переливали собранную слюну в центрифужные пробирки («Thermo Fisher Scientific», США). Мазки с внутренней стороны щеки получали с помощью стерильного полиэфирного зонда-тампона с пластиковым аппликатором («МиниМед», Россия). Для выделения нуклеиновых кислот использовали систему ДНК MagMAX™ Pathogen RNA/DNA Kit («Thermo Fisher Scientific», США). ПЦР-РВ проводили с использованием тест-системы IDEXX RealPCR ASFV DNA Mix («IDEXX», США). Для обнаружения антител к белкам вируса АЧС в сыворотке крови свиней применяли тест-систему ID Screen® African Swine Fever Competition («IDVet», Франция). Была установлена линейная зависимость между показателями Ct и инфекционными титрами в 10-кратных разведениях вирусосодержащих суспензий, полученных при заражении культуры клеток ЛС вирусом АЧС штаммов Мозамбик-78 или Ставрополь 01/08. Это позволило переводить данные, полученные при дальнейшем исследовании проб крови и ротовой полости в ПЦР-РВ, в значения инфекционных титров. Из 10 животных, которым инокулировали штамм МК-200, только у трех было зарегистрировано кратковременное (на 1-2 сут) повышение температуры тела выше физиологической нормы (40,1-40,6 °С) в период с 5-х по 7-е с.п.и. У остальных животных на протяжении первых 10 сут температура тела соответствовала показателям физиологической нормы. В период с 8-х по 77-е с.п.и. у всех свиней клинические признаки АЧС отсутствовали. В исследуемых образцах вирусную ДНК выявляли с 3-5-х сут с.п.и. Минимальные показатели (максимальное количество исследуемой матрицы) порогового цикла (Ct) при постановке ПЦР-РВ установлены в период с 17-21-х с.п.и., доля положительных проб в исследованных образцах достигала 60-100 %. Рассчитанные на основании линейной зависимости между инфекционными титрами вируса АЧС и показателями Ct значения виремии не превышали 104,0 ГАЕ50/мл в период с 0-х до 63-х с.п.и. и были ниже 101,9 ГАЕ50/мл с 70-х с.п.и. В течение эксперимента у животных наблюдали цикличную виремию и формирование возможности вирусовыделения через ротовую полость. Это указывает на риски горизонтальной и вертикальной передачи вакцинного штамма восприимчивым свиньям при прямом или непрямом контактах. Разработчикам кандидатных живых вакцин против АЧС рекомендовано предоставлять данные об исследовании виремии и вирусовыделения за период от 2,5 до 4 мес после прививки.
Бесплатно
Иммуногенность и инвазивность микроорганизмов рода Bacillus при пероральном применении
Статья научная
Иммуномодулирующие эффекты пробиотиков на основе микроорганизмов рода Bacillus связаны с их способностью к проникновению через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в кровеносную систему. Представляется перспективным создание рекомбинантных вакцин на основе микроорганизмов рода Bacillus , продуцирующих рекомбинантные антигены наиболее значимых и антигенно изменчивых вирусных и бактериальных агентов сельскохозяйственной птицы, свиней и крупного рогатого скота. Проблема пероральной вакцинации заключается в развитии пищевой иммунотолерантности, связанной с вовлечением в реакции адаптивного иммунитета CD4+ и CD8+/Treg лимфоцитов, подавляющих иммунный ответ в отношении вводимого антигена. В настоящей работе впервые показано, что наличие инвазивности у микроорганизмов родов Bacillus и Geobacillus служит важным, но не единственным фактором, определяющим их иммуногенность. Мы установили, что, помимо B. subtillis, в качестве средства доставки рекомбинантных антигенов можно рассматривать B. atrophaeus. Нашей целью был поиск штаммов рода Bacillus, обладающих оптимальной инвазивностью и иммуногенностью, как пероральных средств доставки рекомбинантных антигенов с эффектом преодоления пищевой иммунотолерантности. Культуры микроорганизмов рода Bacillus были предоставлены Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН) (22 культуры) и ООО «СибАФ» (г. Бердск) (7 культур). Идентификацию культур проводили методом секвенирования 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру. Штаммы высевали на 3 % триптиказо-соевой бульон (TSB), 0,5 % дрожжевой экстракт (YE) и 1,5 % агар Bacto («BD Biosciences», США), после чего инкубировали при 37 °C в течение 16 ч. Бактериальные клетки инактивировали прогреванием при 65 °С в течение 3 ч и добавлением фурацилина до концентрации 0,1 %. Культуры 29 штаммов тестировали на иммуногенность in vivo на мышах-гибридах F1 (A/Sn × Balb/C). Животным выпаивали перорально через зонд по 200 мкл культуральной жидкости микроорганизмов родов Bacillus и Geobacillus в концентрации 0,7 ед. McF, 3-кратно с интервалом 7 сут. Через 3 нед брали кровь для серологических исследований. Показатели иммуногенности и инвазивности оценивали в реакции агглютинации с флуоресцентно меченными О-антигенами. Реакцию агглютинации проводили с сыворотками крови мышей. Инвазивность при пероральном введении культур рода Bacillus оценивали посредством постановки биопробы на 10-суточных цыплятах (Gallus gallus L.) кросса Shaver. Ежесуточно в течение 10 сут цыплятам вводили 1-суточную культуру исследуемого микроорганизма в дозе 200 мкл орально (1 млрд КОЕ/мл). На 11-е сут проводили убой и делали посевы биоматериала (мышцы, печень и сердце) на мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. Также анализировали инвазивность микроорганизмов рода Bacillus на мышах линии С57Black. Животным вводили орально по 100 мкл культуры микроорганизма 1 раз в сутки в течение 2 сут подряд. На 3-и сут проводили убой и делали посевы материала печени и сердца на Eugonic агар, мясопептонный агар и в мясопептонный бульон. При проведении теста на наличие биосурфактантной активности Oil spreading assay культуральную жидкость разводили дистиллированной водой и вносили 20 мкл нефти. В качестве негативного контроля использовали дистиллированную воду, в качестве позитивного контроля - SDS (sodium dodecyl sulfate, 1 % v/v). Разрушение нефтяного пятна учитывали как положительный результат. Только 27,5 % культур микроорганизмов рода Bacillus инициировали образование антител к собственным корпускулярным антигенам при пероральном введении мышам F1 (A/Sn × Balb/C). Среди изученных культур B. subtilis образование антител вызывали 71,42 %. Образование антител также стимулировали культуры других видов: B. atrophaeus B8, изолят B23 B. zhangzhoulensis (по другим источникам отнесен к B. pumilus или B. safensis), штамм B. licheniformis В10. Большинство микроорганизмов рода Bacillus не стимулировали продукцию антител к собственным антигенам. Культуры B. mucoides / B. weihenstephanensis B31, B. simplex B32, B. thuringiensis B20, B. subtillis, B. amyloliquefaciens 2-15, Bacillus spp. 1’-37-7 оказывали патогенное действие, сопровождавшееся гибелью мышей при пероральном введении: погибало от 25 до 50 % особей. При пероральном введении культур рода Bacillus птице у всех опытных кур грудные и бедренные мышцы были контаминированы на 100 %, печень и сердце - соответственно на 96 и 52 %. Инвазивность для мышей характеризовалась выявлением микроорганизмов в образцах печени и сердца через 18 ч после последнего перорального введения. Устойчивой инвазивностью обладали культуры Bacillus spp. B56, Bacillus spp. В50, B. atrophaeus B8 и B. safensis В23. Однако антитела были обнаружены только к B. atropheus B8 и B. safensis В23.
Бесплатно
