Иммуногематологические характеристики и функциональная активность клеток крови крупного рогатого скота при действии малых доз ионизирующего излучения

Введение. Ионизирующее излучение от техногенных радионуклидов, находящихся в экосистеме, входит в перечень факторов, оказывающих негативное действие на человека и биологические объекты. На территории РФ есть регионы с напряженной радиационной ситуацией, это определяется размещением радиационно опасных объектов, Красноярский край относится к таким территориям. На основе сведений ежегодного мониторинга радиационной ситуации на большей части Красноярского края радиационная обстановка оценивается как благополучная. На территории края выявлено очаговое, точечное загрязнение поймы р. Енисей антропогенными радионуклидами, загрязнение было сформировано в результате деятельности ФГУП «Горно-химический комбинат». Установленное техногенное загрязнение точечное, имеет различный радионуклидный состав, оно регистрируется в р. Енисей на всем протяжении от Горнохимического комбината до Карского моря [1].

Вопросам оценки миграционной способности техногенных радионуклидов между компонентами биосистем, моделированию ее активности на загрязненных территориях в настоящее время уделяется значительное внимание радиоэкологов. На многих загрязненных территориях детально изучена миграционная активность основных дозообразующих техногенных радионуклидов [2, 3]. При инкорпорировании и накоплении радионуклидов в биологических объектах разного уровня трофической цепи создается опасность их повреждения в результате внутреннего облу- чения даже при уровне загрязнения среды ниже допустимого, но выше фонового.

Ионизирующее излучение, даже в малых дозах, активно действует на гемопоэтическую ткань, изменяет биохимические показатели крови у сельскохозяйственных животных [4]. У коров, содержащихся в условиях низкодозового облучения, выявлено увеличение фагоцитарного индекса нейтрофилов периферической крови [5]. Установлено, что процессы генерации активных форм кислорода (АФК) клетками организма являются чувствительными к воздействию незначительных доз радиации [6]. Процесс формирования АФК клетками организма в ответ на антигенное внедрение in vitro , фиксируемый хемилюминесцентным методом в крови, отражает динамичность функционирования каскадно-действующих про- и антиоксидантных ферментов клеточных клеток крови [7, 8]. В связи с недостаточностью знаний о механизмах воздействия низкоинтенсивной радиации существуют трудности с прогнозированием результатов этих воздействий на организмы, преодолением их негативных последствий и использованием их положительных результатов.

Цель исследования: определение уровня и интенсивности продукции АФК в периферической крови лактирующих коров при воздействии низких поглощенных доз ионизирующего излучения.

Материалы и методика исследования. Исследование было проведено в 2018–2020 гг. в среде агробиоценозов трех населенных пунктов Красноярского края. Населенные пункты имеют различный радиоэкологический статус, с. Б. Балчуг и с. Момотово территориально принадлежат ЗН ФГУП ГХК, в агробиоценозах, расположенных на берегу р. Енисей, этих населенных пунктов выявлены участки с дополнительной техногенной нагрузкой. Поселок Борск являлся контрольным, почвы и вода этого пункта не имеют дополнительного техногенного загрязнения.

В периоды санитарно-ветеринарного обследования у лактирующих коров черно-пестрой и красно-пестрой пород были отобраны пробы периферической крови. В п. Момотово было исследовано 20 проб крови (средний возраст животных – 71±14 мес.), в с. Б. Балчуг – 11 проб (средний возраст животных – 60 мес.), животные принадлежали частным владельцам. В п. Борск исследовано 20 проб крови (средний возраст животных – 72±6 мес.), животные принадлежали ООО «Мин-дерлинское». Населенные пункты и ООО «Миндер-линское» являются благополучными по заразным заболеваниям, животные соматически здоровы.

Анализ гематологических показателей выполнялся по общепринятым методикам [9]. Фагоцитарную активность клеток венозной крови исследовали через 3 ч после антигенной активации in vitro частицами латекса, опсонизированными белками пуловой сыворотки крови крупного рогатого скота, при окраске 0,25 % генцианвиолетом в 3 % растворе уксусной кислоты по окончании фиксации хемилюминесцентным способом по методу В.М. Земскова образования первичных и вторичных радикалов клетками венозной крови [8]. Хемилюминесцентная кинетика спонтанной и активированной генерации первичных и вторичных радикалов определялась на «Хемилюминометр 3604-ПЭВМ». Для усиления люминесценции применяли люцигенин и люминол, которые обладают селективностью к первичным и вторичным радикалам кислорода соответственно. Регистрация хемилюминесцентной кривой проводилась в течение 3 ч, при температуре +38 ° С. Для сравнительного анализа использовали основные параметры хемилюминесцентной кинетики генерации АФК: время достижения максимума (Tmax, мин); амплитуду пиков генерации АФК (Imax, имп/с); светосумму под хемилюминесцентной кривой (S, имп/180 мин); индекс активации (ИА = Sакт/Sспонт, усл. ед.).

Дозы облучения лактирующих коров рассчитывали согласно ветеринарным правилам 13.73.13/12-00 «Оценка доз облучения сельскохозяйственных животных на территории, загрязненной радионуклидами». Для статистической обработки полученных данных использовали методы вариационной статистики: критерий Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента на базе программ MS Office Excel 2007. Достоверные отличия параметров хемилюминисценции считали достоверными при Р ≤ 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение . В результате определения поглощенных доз установлено, что суммарная поглощенная доза воздействия (внешнее и внутреннее облучение) у молочных коров в с. Б. Балчуг составила 1,6 мГр/год, в с. Момотово – 1,3 мГр/год, в п. Борск – 0,9 мГр/год. В п. Борск величина поглощенной дозы находилась в пределах значений, характеризующих глобальный техногенный фон, который регистрируется на всей территории Красноярского края. В результате расчета выявлено, что доза облучения лактирую-щих коров в с. Момотово в 1,5 раза, с. Б. Балчуге в 1,7 раза выше, чем в п. Борске. Полученные значения поглощенных доз принадлежат диапазону низких доз, согласно рекомендации научного комитета по атомной энергии при ООН.

На основании гематологического анализа периферической крови выявлено, что СОЭ, количество форменных элементов крови у лактирующих коров при дозах 1,6; 1,3 и 0,9 мГр/год находятся в одном диапазоне изменчивости, соответственно не отличаются. Фагоцитарный индекс лейкоцитов крови коров при дозе 0,9 мГр/год составил 36,6±1,5 %, при дозе 1,3 мГр/год – 37,8±2,3 %, при воздействии 1,6 мГр/год – 43,6±2,5 %. Полученные данные принадлежат одному диапазону изменчивости, соответственно статистически не отличаются.

Хемилюминесцентная кинетика генерации первичных и вторичных АФК клетками венозной крови у лактирующих коров характеризовалась двумя максимумами и имела специфические особенности для крови животных с территорий с различной дозовой нагрузкой.

Значения времени достижения максимумов генерации первичных АФК клетками крови у млекопитающих, находящихся под воздействием доз облучения 1,3; 1,6 и 0,9 мГр/год, достоверно не отличались. У всех животных величина времени достижения первого максимума спонтанной продукции люцигенинзависимых радикалов в среднем регистрировалась на 22-й мин, второго максимума – на 132-й мин. При антигенной активации in vitro клеток крови частицами опсонизированного латекса выход кинетики генерации люцигенинзависимых АФК на первый максимум регистрировался в среднем к 23-й мин, второй максимум достигался на 139-й мин.

Первый максимум интенсивности спонтанной генерации вторичных АФК у всех животных не- зависимо от дозы облучения регистрировался на 18,6-й мин. Значение времени достижения второго максимума интенсивности генерации вторичных радикалов у крупного рогатого скота при воздействии доз 1,6 и 0,9 мГр/год находилось в одном диапазоне изменчивости и в среднем составляло 169 мин. У крупного рогатого скота при дозе 1,3 мГр/год выявлено достоверное (критерий Стьюдента Р < 0,01) сокращение времени формирования второго максимума кинетики спонтанной генерации люминолзависимых АФК до 138,1±6,5 мин. При активации клеток крови in vitro частицами латекса самое короткое время образования первого максимума хемилюминесцентной кинетики генерации люминолзависимых АФК (17,4±2,2 мин) было выявлено у коров при дозе 0,9 мГр/год. У крупного рогатого скота при воздействии доз облучения 1,3 и 1,6 мГр/год наблюдалась достоверная (P < 0,01) задержка на 7,5±1,5 мин выхода на первый пик хемилюминесцентной кривой. Время достижения второго пика хемилюминесцентной кривой генерации вторичных люминолзависимых АФК антигенактивиро-ванными клетками не зависело от дозы облучения и в среднем регистрировалось на 135 мин.

При оценке амплитуды первого максимума интенсивности генерации (Imax(I), имп./с) первичных радикалов было установлено, что ее значение при спонтанной и активированной генерации АФК в крови у животных достоверно не изменяется (рис. 1). Но для антигенактивирован-ной продукции АФК проявляется тенденция снижения величины максимума с увеличением дозы облучения.

Доза обличения. мГр год

Рис. 1. Амплитуда первого максимума хемилюминесцентной кинетики генерации первичных АФК

При увеличении дозы облучения отмечалось увеличение амплитуды второго максимума (Imax(II), имп/с) кинетики спонтанной и активированной генерации первичных АФК в крови (табл.), особенно ярко это проявлялось при спонтанной генерации АФК. У лактирующих коров при поглощенной дозе в 0,9 мГр/год значения амплитуды второго максимума кинетики спонтанной и анти-генактивированной генерации АФК совпадали.

Амплитуда второго максимума хемилюминесцентной кинетики генерации люцигенинзависимых АФК

Доза облучения, мГр/год	I max (II), имп/с
	Спонтанная генерация	Активированная генерация
0,9	919,4±138,3	913,2±102,53
1,3	1383,0±252,1	824,7±85,6 *
1,6	1582,0±284,3	1355,7±215,8

*Р < 0,05.

Особенность изменения кинетики генерации люцигенинзависимых АФК при антигенной стимуляции клеток крови частицами латекса относительно кинетики их спонтанной продукции выражалась в снижении величины и первого, и второго максимума, наиболее ярко выражена у животных, находящихся под воздействием дозы облучения в 1,6 мГр/год (Р < 0,05).

Амплитуда первого максимума (Imax(I), имп/с) спонтанного образования вторичных радикалов у лактирующих коров, находящихся под воздействием доз 1,3 и 1,6 мГр/год, была достоверно ниже (критерий Стьюдента – Р < 0,05, критерий Манна-Уитни – Р < 0,01) по сравнению с данными, полученными при воздействии дозы 0,9 мГр/год. Активация частицами латекса обуславливает увеличение генерации вторичных радикалов, наиболее ярко этот процесс протекает у животных при воздействии дозы в 0,9 и 1,6 мГр/год (рис. 2), критерий Манна-Уитни для поглощенной дозы 1,3 мГр/год составил Р < 0,01, для дозы в 1,6 мГр/год – Р < 0,01.

Доза облучения, мГр/год

Рис. 2. Амплитуда первого максимума (Imax(I)) хемилюминесцентной кинетики генерации люминолзависимых АФК

Значение амплитуды второго максимума образования (Imax(II), имп/с) спонтанных и активированных вторичных активных форм кислорода (люминолзависимых) у лактирующих коров не имела зависимости от значений поглощенной дозы облучения.

Суммарное количество спонтанно генерирующихся первичных радикалов в периферической крови молочных коров при поглощенных дозах в

1,6 и 1,3 мГр/год значимо (Р < 0,05 по Стьюденту) выше, чем при воздействии поглощенной дозы в 0,9 мГр/год (рис. 3). При инициации фагоцитарной активности клеток крови введением частиц латекса суммарная продукция АФК в крови у животных под воздействием дозы в 0,9 мГр/год возрастает в 1,26 раза, тогда как у животных под воздействием доз 1,3 и 1,6 мГр/год наблюдается угнетение образования АФК.

Доза облучения, мГр/год

Рис. 3. Светосумма первичных радикалов при спонтанном и антигенактивированном образовании АФК

Суммарное число спонтанно генерирующихся вторичных активных форм кислорода, формирующихся в венозной крови при дозах 0,9; 1,3 и 1,6 мГр/год статистически не отличаются. При воздействии антигена в условиях in vitro в венозной крови регистрируется увеличение продукции вторичных радикалов, наиболее ярко это наблюдается при дозе 0,9 мГр/год (увеличение на 4,1 раза). Увеличение продукции вторичных радикалов в ответ на антигенное воздействие является физиологичным процессом. У животных при действии доз 1,3 и 1,6 мГр/год увеличение АФК менее выражено, при этих дозах рост АФК составил 1,9 и 3,6 раза соответственно. Суммарный объем вторичных антигенактивированных радикалов, образующихся в периферической крови при дозах 1,3 и 1,6 мГр/год, достоверно (критерий Стьюдента – Р < 0,01) ниже, чем у животных при дозе 0,9 мГр/год (рис. 4), что указывает на снижение реактивной способности клеток венозной крови.

Доза облучения, м/год

Рис 4. Светосумма вторичных радикалов при спонтанном и антигенактивированном образовании АФК

На основе данных по суммарному объему образованных за 3 ч в венозной крови крупного рогатого скота первичных, вторичных радикалов при спонтанной и антигенактивированной генерации было определено значение индекса активации процесса хемилюминесценции, индекс показывает реактивную способность клеток периферической крови организма к продукции свободных радикалов в ответ на внедрение антигена (рис. 5).

Поглощен пая доза, мГр/год

Рис 5. Индекс активации генерации АФК клетками периферической крови крупного рогатого скота

При воздействии поглощенных доз в значениях 0,9; 1,3 и 1,6 мГр/год индекс активации генерации первичных и вторичных радикалов принадлежит одному диапазону изменчивости. Однако установлена тенденция к снижению индекса активации люминолзависимых радикалов.

При действии малого ионизирующего излучения в диапазоне низких доз – 1,3 и 1,6 мГр/год у крупного рогатого скота в венозной крови выявлены отличия хемилюминесцентной кинетики генерации АФК, которая интегрально отражает кинетику последовательной активации про- и антиоксидантных составляющих системы крови при антигенной активации и без нее. При малых разведениях крови первый максимум характеризует кинетику респираторного взрыва при активации фагоцитирующих клеток крови опсонизированными частицами латекса (адгезия, поглощения частиц латекса), а без антигенной активации – реакцию фагоцитирующих клеток на собственные, «деформированные» молекулярные структуры при инкубации крови вне организма. Второй пик антигенстимулированной генерации АФК обусловлен эндогенной активацией «резервных» нейтрофилов [10, 11], а также образованием липидных и белковых пероксидов [7].

Кинетика спонтанной генерации первичных люцигенинзависимых радикалов в крови животных под воздействием доз 1,3 и 1,6 мГр/год по интегральному объему АФК (S) достоверно превышала показатели животных при действии дозы 0,9 мГр/год. Антигенная активация клеток крови in vivo сопровождалась снижением генерации люцигенинзависимых АФК у животных при действии доз 1,3 и 1,6 мГр/год, тогда как у животных при дозе 0,9 мГр/год сохранялась на том же уровне.

Повышение дозы облучения сопровождалось увеличением продукции свободных радикалов, не связанной с процессом фагоцитоза эндогенного антигена, это ярко выражено для животных с дозой облучения 1,6 мГр/год. Очевидно, это следствие истощения компонентов антиоксидантной активности венозной крови.

Суммарное число первичных АФК, спонтанно образующихся в крови лактирующих коров под воздействием дозы облучения в 1,3 и 1,6 мГр/год, достоверно (критерий Стьюдента – Р < 0,05) выше, а вторичных, образованных при антигенной активации in vitro , достоверно (критерий Стьюдента – Р < 0,01) ниже, чем у коров при поглощенной дозе 0,9 мГр/год.

Индекс активации образования первичных и вторичных АФК у крупного рогатого скота с территории с дозой облучения в 1,3 мГр/год в 1,4 раза меньше, чем у животных при действии дозы 0,9мГр/год, что указывает на снижение резервных возможностей нейтрофилов к генерации АФК.

Увеличение значения ИА генерации вторичных радикалов при дозе облучения в 1,6 мГр/год связано либо с резким увеличением продукции липидных перекисных радикалов, либо с присутствием «незрелых» нейтрофилов [10, 11], либо с недостаточной активностью антиоксидантной системы клеток и плазмы крови, под контролем которой находится образование липоперекисей [7].

Выводы . В результате исследования выявлено, что у крупного рогатого скота при поглощенных дозах 1,3 и 1,6 мГр/год и при дозе 0,9 мГр/год статистически не отличаются: СОЭ, количество эритроцитов, лейкоцитов и их фагоцитарная активность. У крупного рогатого скота, находящегося под воздействием доз облучения в 1,3 и 1,6 мГр/год, выявлено снижение суммарного количества вторичных АФК, генерируемых анигенактивированными клетками, и увеличение суммарного количества спонтанно генерируемых первичных АФК.

Из выявленных закономерностей следует, что у крупного рогатого скота процессы генерации активных форм кислорода, играющие ведущую роль в противомикробном и противоопухолевом иммунитете иммунокомпетентными клетками в процессе функционирования (например фагоцитоз) и регулируемые активностью про- и антиоксидантных систем организма, являются чувствительными к воздействию слабых доз ионизирующего излучения.