Иммуногенность поливидовой вакцины против хламидиоза для лабораторных животных

Хламидиоз получил широкое распространение среди домашних и сельскохозяйственных животных [1, 4, 5]. В первую очередь это связано с тропностью данного вида патогенна, которая обуславливает возможность паразитирования хламидий на различных видах животных и птиц, как диких, так и одомашненных, что в свою очередь способствует бесконтрольной циркуляции данного патогенна в окружающей среде.

В основу стратегии борьбы с хламидиозом животных легла вакцинопрофилактика. На данный момент на рынке ветеринарных препаратов имеются вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, свиней и лошадей, однако, учитывая изменчивость всех микроорганизмов, в том числе хламидий, имеется необходимость актуализации антигенного состава имеющихся вакцин с целью повышения иммуногенности [1].

Ранее нами был выделен зоонозный штамм хламидий в неблагополучном по хламидиозу козоводческом хозяйстве [3]. В ходе сравнения нового штамма с производственными штаммами нами были выявлены различия в их антигенных свойствах, которые напрямую влияли на уровень защиты иммунизированных животных [2, 6]. Исходя из этого, с целью повышения иммуногенности, ранее разработанной и внедренной в ветеринарную практику «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» (рег. уд. №66-1-6.14-2140) и расширения области ее применения была сконструированная новая антигенная композиция для создания поливидовой вакцины против хламидиоза животных. В ее состав вошли три наиболее иммуногенные штаммы хламидий «АМК-16», «250» и «РС-85». Эта антигенная композиция была предварительно испытана с различными адъювантами на лабораторных животных в результате чего был отобран наиболее эффективный из них, позволяющий вызывать наибольший иммунный ответ при минимальной реактогенности [1]. В результате удалось создать поливидовую эмульсионную вакцину против хламидиоза животных на основе трех штаммов хламидий, выделенных при различных патологиях от разных видов животных.

Далее, необходимо было подтвердить, что подобранная штаммовая композиция способна защитить животных от широкого спектра циркулирующих у разных животных штаммов хламидий, что и явилось целью данного исследования.

Материал и методы исследований.

Работа проводилась в отделе вирусологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» согласно Тематического плана НИР в 2020-2022 годы.

В работе были использованы штаммы С. psittaci:

• -    «АМК-16» – выделен от козы, (инфекционный титр 10^-5,4LD 50 /0,3 ml);

• -   «250»   – выделен от коровы

(инфекционный титр 10^-6,5LD 50 /0,3 ml);

• -  «РС-85»  – выделен от свиньи

(инфекционный титр 10^-6,5LD 50 /0,3 ml);

• -    «Урманаево-70» – выделен от овцы (инфекционный титр 10^-4,8LD 50 /0,3 ml);

• -  «СК-89»  – выделен от теленка

(инфекционный титр 10^-4,8LD 50 /0,3 ml);

• -  «ЛС-87»  – выделен от свиньи

(инфекционный титр 10^-6,5LD 50 /0,3 ml);

• -  «Саба-20»  – выделен от козы

(инфекционный титр10^-5,1LD 50 /0,3 ml).

Антигенный состав вакцины был скомбинирован из штаммов хламидий «250», «РС-85» и «АМК-16» в соотношении 1:1:2 соответственно.

Оценку стерильности вакцины проводили в соответствии с ГОСТ 28085-2013.

Безвредность             вакцины подтверждали путем постановки биопробы на белых мышах согласно ГОСТ 319262013.

Изучение антигенной активности поливидовой вакцины проводили на шести морских свинках и шести кроликах. Всех животных каждого вида иммунизировали путем внутримышечного введения в объемах 0,2 см3 морским свинкам и 1 см3 кроликам. Исследование проводили в течение шести месяцев. Каждые 30 суток от всех животных отбирали пробы сыворотки крови и исследовали их в РСК.

Серологические      исследования проводили с применением «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики               хламидиозов сельскохозяйственных животных» (РОСС RU.ФВ01.Н00022).      Иммуногенность вакцины оценивали в острых опытах на белых мышах (БМ) и кроликах.

Изучение иммуногенности на белых мышах с гомологичными в антигенном отношении штаммами хламидий, из которых изготовлена вакцина, проводили на 120 белых мышах, из которых было сформировано три группы, каждая из которых была разделена на две подгруппы (опытную и контрольную) по 20 животных. Животных     опытных     подгрупп иммунизировали поливидовой вакциной в объеме 0,1 см3 с ревакцинацией в том же объеме, через 14 суток. На 30 сутки, после первой прививки, проводили заражение животных всех подгрупп штаммами хламидий «АМК-16», «РС-85» и «250». Каждым штаммом инфицировали по одной группе белых мышей. Инфекционный материал вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 см3. Иммуногенность вакцины оценивали по разнице выживших животных в вакцинированных и контрольных подгруппах.

Изучение иммуногенности вакцины в остром опыте на белых мышах с гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий проводили по аналогичной схеме, только заражение животных проводили штаммами хламидий «СК-89», «Урманаево-70» и «ЛС-87».

Изучение антигенной активности и иммуногенности поливидовой вакцины на кроликах проводили также с гомологичными и гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий. В первом эксперименте было отобрано восемь голов крольчих, которые были разделены на две группы по четыре особи. Животных первой группы иммунизировали поливидовой вакцинной в объеме 1 см3. Вторая группа являлась контролем. Через 30 суток после иммунизации животных двух групп скрещивали с самцами. На 12-14 сутки беременности проводили заражение животных всех групп смесью из трех гомологичных в антигеном отношении штаммов хламидий «АМК-16», «РС-85» и «250». Инфекционный материал вводили внутрибрюшинно в объеме 1 см3. Эффективность вакцины оценивали по результатам окрола кроликов, наличию или отсутствию клинических признаков хламидийной инфекции, а также по результатам вирусологических исследований (выделение хламидий на куриных эмбрионах).

Исследование с гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий проводили по аналогичной схеме, только заражение животных проводили смесью из штаммов «Урманаево-70» и «Саба-20».

Результат исследований. На первом этапе исследований изучали антигенную активность поливидовой вакцины на лабораторных животных. На рисунке 1 представлена динамика накопления специфических хламидийных антител     в     сыворотках     крови вакцинированных морских свинок и кроликов.

Рисунок 1 – Динамика накопления специфических хламидийных антител в сыворотке крови

иммунизированных морских свинок и кроликов

Таблица 1 – Иммуногенность поливидовой вакцины против хламидиоза животных на белых мышах с применением гомологичных штаммов хламидий

Номер группы	Подгруппа животных	Штамм хламидий	Кол-во животных в опыте	Выжило животных
				кол-во	%
1	Опытная	«АМК-16	20	16	80
	Контрольная		20	5	25
2	Опытная	«260	20	17	85
	Контрольная		20	4	20
3	Опытная	«РС-85»	20	16	80
	Контрольная		20	6	30
Средний % выживших животных	Опытная		60	49	81,6
	Контрольная		60	15	25

Из экспериментальных данных, представленных на рисунке 1, видно, что введение поливидовой вакцины морским свинкам и кроликам вызывало у них выработку специфических хламидийных антител. Максимальные титры антител у двух видов животных были выявлены на 60 сутки после введения препарата в среднем титре 1:213 у морских свинок и 1:200 у кроликов. Далее, в обоих случаях, наблюдали плавное снижение концентрации комплементсвязывающих антител. На 180 сутки уровень специфичных хламидийных иммуноглобулинов находился в пределах средних титров по группам 1:66 – у морских свинок и 1:60 – у кроликов. Полученные результаты свидетельствуют о высокой антигенной активности исследуемой вакцины.

Следующим этапом были проведены исследования по изучению иммуногенности поливидовой вакцины в остром опыте на белых мышах. Исследования проводили как с гомологичными в антигеном отношении штаммами хламидий (штаммы из которых изготовлена вакцина) и гетерологичных в антигеном отношении штаммами.

В таблице 1 представлены результаты оценки иммуногенности поливидовой вакцины в остром опыте на белых мышах инфицированных штаммами хламидий из антигенов, которых была изготовлена вакцина.

Как видно из таблицы 1 во всех опытных (иммунизированных) подгруппах количество выживших животных варьировалось в пределах от 80 до 85 %. В то время как в контрольных группах выживаемость белых мышей после заражения штаммами хламидий «АМК-16», «250» и «РС-85» была равна 25 %, 20 % и 30 % соответственно. Средний процент выживших животных в трех опытных подгруппах составил 81,6 %. Аналогичный показатель в контрольных подгруппах не превысил 25 %.

В таблице 2 представлены результаты оценки иммуногенности поливидовой вакцины в остром опыте на белых мышах, инфицирование которых проводили гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий.

Таблица 2 – Иммуногенность поливидовой вакцины против хламидиоза животных на белых мышах

Номер группы	Подгруппа животных	Штамм хламидий	Кол-во животных в опыте	Выжило животных
				кол-во	%
1	Опытная	«СК-89»	20	14	70
	Контрольная		20	4	20
2	Опытная	«Урманаево-70»	20	13	65
	Контрольная		20	2	10
3	Опытная	«ЛС-87»	20	18	90
	Контрольная		20	8	40
Средний % выживших животных	Опытная		60	45	75
	Контрольная		60	14	23,3

Из экспериментальных данных, представленных в таблице 2, видно, что в опытных (вакцинированных) подгруппах животных процент выживших белых мышей был выше, чем в контрольных группах. В подгруппе иммунизированных животных, зараженных штаммом «СК-89» процент выживших белых мышей составил 70 %. В контрольной подгруппе, зараженной этим же штаммом, выжило только 20 % мышей. В опытной подгруппе, инфицированной штаммом «Урманаево-70», выжило 65 % животных, тогда как в контрольной подгруппе количество выживших не превысило 10 %. В подгруппе вакцинированных мышей, инфицированных штаммом «ЛС-87» наблюдали наиболее высокий процент выживаемости животных, который составил 90 %, при 40 % выживаемости в контрольной группе.

Средний процент выживаемости белых мышей в опытных подгруппах, по двум сериям опытов (с гомологичными и гетерологичными штаммами), составил 78 %. В контрольных подгруппах данный показатель находился в пределах 24 %. Полученные данные свидетельствуют о способности исследуемого вакцинного препарата вызывать выработку противохламидийного иммунитета у иммунизированных лабораторных животных (белые мыши).

Кроме того, средние показатели выживаемости былых мышей в опытных группах, зараженных гомологичными и гетерологичными штаммами хламидий, были сопоставимы: 81 % и 70 % соответственно. Это говорит об иммуногенности испытуемой вакцины к отличным в антигенном отношении штаммам и позволяет предполагать ее высокую эффективность в естественных условиях, где в разных областях и хозяйствах, у разных видов животных, циркулируют различные в антигенном отношении штаммы.

Следующим этапом исследований явилось изучение способности поливидовой вакцины против хламидиоза животных предотвращать аборты хламидийной этиологии у иммунизированных животных. Исследование проводили на беременных кроликах с гомологичными и гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий.

В начале исследования иммунизировали поливидовой вакциной крольчих двух опытных групп. На 30 сутки после вакцинации провели скрещивание всех крольчих с самцами. На 42 сутки после иммунизации провели экспериментальное заражение. С целью подтверждения наличия ответной реакции иммунной системы животных на введение вакцинного препарата и инфекционного материала для заражения на 14, 28, 42 сутки после иммунизации и на 30 и 45 сутки после заражения у кроликов отбирали пробы сыворотки крови и исследовали в РСК. Результаты серологических исследований сыворотки крови кроликов, инфицированных гомологичными в антигенном отношении штаммами хламидий, представлены на рисунке 2.

Результаты серологических исследований сыворотки крови кроликов опытной и контрольной группы, зараженных гетерологичными в антигенном отношении штаммами хламидий, представлены на рисунке 3.

Рисунок 2 – Динамика средних титров специфических хламидийных антител у кроликов, иммунизированной и контрольной групп до и после контрольного заражения гомологичными

штаммами

Рисунок 3 – Динамика средних титров специфических хламидийных антител у кроликов, иммунизированной и контрольной групп до и после контрольного заражения

гетерологичными штаммами

Как видно из рисунков 2 и 3, в двух иммунизированных группах животных, после введения вакцинного препарата, наблюдали положительную динамику роста титров хламидийных антител. Так на 42 сутки после вакцинации в опытной группе животных, заражение которых далее проводили гомологичными штаммами хламидий, средний титр по группе составил 1:104 (рисунок 2). В опытной группе животных, заражение которых в последствии проводили гетерологичными штаммами, средний титр перед инфицированием (42 сутки) был равен 1:73.

В контрольных группах, в двух случаях, до инфицирования хламидийные антитела не выявлялись. Их наличие в сыворотке крови кроликов было выявлено, в первом и во втором случае, на 30 и 45 сутки после заражения.

Результат исхода окрола крольчих опытной и контрольной групп, инфицированных гомологичными в антигеном отношении штаммами хламидий, представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Экспериментальное заражение гомологичными в антигенном отношении штаммами хламидий («250», «РС-85», «АМК-16»)

Группа	Номер кролика	Исход окрола	Всего родилось крольчат	Кол-во павших и м/р крольчат	Кол-во выживших крольчат	Реизоляция хламидий на РКЭ
Иммунизированная	1	Роды	6	0	6	-
	2	Роды	7	1	6	-
	3	Роды	7	1	6	-
	4	Роды	5	0	5	-
Итого по группе			25	2	23	-
% выживших крольчат по группе						92
% павших крольчат по группе						8
Контроль	5	Аборт	6	6	0	+
	6	Роды, м/р*	5	4	1	+
	7	Аборт	7	7	0	+
	8	Аборт	6	6	0	+
Итого по группе			24	23	1	+
% выживших крольчат по группе						4,1
% павших крольчат по группе						95,9

Как видно из таблицы 3 в группе иммунизированных животных у всех крольчих наблюдали положительный исход окрола. Всего в группе родилось 25 крольчат, из них 23 остались живыми. Количество выживших животных по группе составило 92 %. Реизолировать хламидии на куриных эмбрионах от крольчат этой группы не удалось.

В контрольной группе животных, после контрольного заражения, у трех крольчих наблюдали аборты. От одной крольчихи, в результате окрола, было получено 5 крольчат, 4 из которых родились мертвыми. Всего было получено

24 крольчонка, из низ выжил только 1. Процент выживших животных составил 4,1 %. От крольчат каждой крольчихи данной группы удалось реизолировать хламидии на шестисуточных куриных эмбрионах.

В таблице 4 представлены результаты окрола крольчих опытной и контрольной групп, инфицированных гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий.

Как видно из таблицы 4, в иммунизировнной группе животных у двух крольчих наблюдали положительный исход окрола. У двух других животных этой группы не весь приплод на момент окрола оказался жизнеспособным. У крольчихи № 1 из четырех крольчат выжило всего два. У крольчихи № 2 из шести крольчат живыми остались только три. Однако, подтвердить хламидийную этиологию нежизнеспособности павших крольчат не удалось. Реизоляция хламидий на развивающихся куриных эмбрионах дала отрицательные результаты во всех случаях. Процент выживших животных в данной группе составил 78 %.

Таблица 4 – Экспериментальное заражение гетерологичными в антигеном отношении штаммами хламидий («Урманаево-70», «Саба-20»)

Группа	Номер кролика	Исход окрола	Всего родилось крольчат	Кол-во павших и м/р крольчат	Кол-во выживших крольчат	Реизоляция хламидий на РКЭ
Иммунизированная	1	Роды, м/р*	4	2	2	-
	2	Роды, м/р*	6	3	3	-
	3	Роды	7	-	7	-
	4	Роды	6	-	6	-
Итого по группе			23	5	18	-
% выживших крольчат по группе						78
% павших крольчат по группе						21
Контроль	5	м/р*	6	6	0	+
	6	м/р*	5	5	0	+
	7	Роды, м/р*	6	2	4	-
	8	м/р*	5	5	0	+
Итого по группе			22	18	4	+
% выживших крольчат по группе						18
% павших крольчат по группе						81

В контрольной группе животных, инфицированных смесью гетерологичных штаммов хламидий, положительный исход окрола наблюдался только у одного кролика. В этом случае из шести крольчат в живых к концу эксперимента остались только четыре крольчонка. В остальных случаях все крольчата на момент окрола были мертвые. Всего по группе было получено 22 крольчонка из них в живых остались только четыре. Хламидийную этиологию мертворождения удалось подтвердить реизоляцией хламидий на куриных эмбрионах. Процент выживших животных составил 18 %.

Всего по двум сериям исследований средний процент выживших животных в иммунизированных группах составил 83 %, при 10,8 % выживаемости в контрольных группах.

Проведенные исследования подтверждают факт способности исследуемого вакцинного препарата предотвращать аборты хламидийной этиологии у иммунизированных лабораторных животных (крольчих) и способствует сохранению и развитию потомства.

Заключение. Исходя из результатов проведенных исследований, было установлено, что антигенная композиция из штаммов С. Psittaci «АМК-16», «250» и

«РС-85», в составе поливидовой вакцины против хламидиоза животных, обладает высокой антигенной активностью и защищает лабораторных животных от развития экспериментальной хламидийной инфекции при заражении широким спектром возбудителей хламидиоза как гомологичными, так и гетерологичными в антигенном отношении штаммами.

Резюме

Целью данного исследования явилось изучение антигенной активности и иммуногенности поливидовой вакцины против хламидиоза в опытах на лабораторных животных. В статье представлена динамика накопления хламидийных антител в сыворотке крови морских свинок и кроликов после вакцинации на протяжении 180 суток. Помимо этого, было экспериментально доказано, что исследуемый биопрепарат вызывает выработку иммунитета у белых мышей, который обеспечивает их защиту при инфицировании гомологичными и гетерологичными в антигенном отношении штаммами хламидий. Также было доказано, что иммунизация беременных кроликов поливидовой вакциной способна предотвращать аборты, вызванные инфицированием животных возбудителями хламидиоза.