Иммунологические механизмы развития приобретенной токсической гемолитической анемии в эксперименте

Гемолитическая анемия - это обширная группа заболеваний красной крови наследственного и приобретенного характера, основным признаком которых является выраженный гемолиз. Причины развития гемолиза весьма разнообразны: от врожденных энзимопатий до токсических воздействий и аутоиммунных нарушений. Это определяет гетерогенность механизмов развития болезни и, следова тельно, клинических проявлений и подходов к лечению [Hiliman, Ault, Kinder, 2005J.

В настоящее время большой интерес для исследования представляют токсические гемолитические анемии, вызванные воздействием различных промышленных реагентов и приемом лекарственных средств [Hematology, 200SJ. Причины и пути развития гемолиза при данных интоксикациях исследованы не до конца. Разрешить спорные вопросы патогенеза токсических гемолитических анемий

(С Сивакова Л В., Мамаева Е. А., Косарева П. В., ХоринкоВ. П* 2016

позволяет экспериментальное моделирование. Для этой цели используется фенилгидразин - всесторонне исследованный экспериментально гемолитический яд. вызывающий выраженное снижение числа эритроцитов и гемоглобина, ретикулопитоз и активирующий костно-мозговое кроветворение [Bergen 2007]. Также в качестве экспериментального гемолитического яда был предложен 2-бутоксиэтанол (или бути л целлозольв), широко используемый реагент, который применяется для органического синтеза, очистки металлов и в производстве лакокрасочных материалов и моющих средств. Было показано его гемолитическое действие на эритроциты человека in vitro [ОИапаует. Sullivan. 1993].

При введении гемолитических ядов в эксперименте поражение эритроцитов обусловлено различными механизмами. Гемолиз может развиваться непосредственно вследствие токсического воздействия вещества и опосредованно, через развитие аутоиммунных реакций против собственных эритроцитов [Garrally. Arndt. 2007; Johnson. Fueger. Gotlscliall. 2007; Garrally. 2009; Moreira-Rodrigues el aL 2010; El-Ashmawy. Gad. Salama. 2010]. Как правило, у этих пациентов отмечается положительный прямой антиглобулиновый тест: появление IgG или IgG и комплемента, в ряде случаев IgG. комплемента и IgA [Belensky el al.. 2014; Bollolle el al. 2014; Haddad. Mohammad. Dai. 2014; Haley el al.. 2014; Joybari el al.. 2014].

Цель; изучение иммунологических механизмов развития приобретенной токсической гемолитической анемии при экспериментальном введении лабораторным животным 2-бутоксиэтанола.

Материалы и методы

Исследования проводились на 40 нелинейных четырехмесячных крысах, весом 150-200 г содержавшихся в стандартных условиях вивария — свободный доступ к воде и пище. 12-14-часовой световой день, в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ № 70Sh от 23.0X2010 г. и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург) от IR 03.I9R6 г. (Текст изменен в соответствии с положениями Протокола (ETS № 170), после его вступления в силу 2 декабря 2005 г: Лиссабонский договор о внесении изменений в Договор о Европейском союзе и Договор об учреждении Европейского сообщества вступили в силу I декабря 2009 г.) в ЦНИЛ ГОУ ВПО III МУ им, ак. Е. А, Вагнера.

Животные были разделены на две группы: первая (контрольная) содержалась в стандартных условиях вивария (п = 20), второй (опытной) вводи ли однократно интраперитонеально 2-бутоксиэтанол в эмпирически выбранной дозе 20 мг/кг, выводили из эксперимента через 10 дней (п = 20).

До начала исследования у животных брали периферическую кровь в количестве 100 мкл - для получения эритромассы, которую хранили при температуре +4°С с гемоконсервантом «Глюги-цир» (Декстроза+Натрия цитрат; ОАО «Синтез»; Россия, г. Курган) из расчета 1 объем глюгицира к 4 объемам крови (согласно прилагаемой инструкции к препарату). По окончании исследований животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, брали материал для цитологического исследования - костный мозг из бедренной кости (для приготовления мазка). Осуществляли также взятие венозной крови для получения сыворотки и постановки реакции агглютинации с аутологичными эритроцитами, взятыми до эксперимента. Пробы инкубировали в течение 2 ч. при температуре +4°С и затем - в течение 30 мин. при температуре +37° С (для выявления действия тепловых и холодовых антител). Результаты реакции оценивали общепринятым способом и выражали с учетом log-нормального распределения данных в виде log2 обратных титров антител (Инструкция по применению диагностику ма клещевого энцефалита сухого для РТГА. РСК. РРГ и РТНГА Минмедпрома СССР; 1990). Расчет log осуществляли при помощи таблицы log. Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Biosial и приложения Microsoft ® Excel полнофункционального офисного пакета Microsoil Office 2007. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным р<0.05.

Результаты и их обсуждение

При проведении реакции агглютинации присутствие антител к собственным эритроцитам выявлено как в группе с изолированным введением бутоксиэтанола (средние значения log — 8.9±13)ч так и в группе с введением бутоксиэтанола в сочетании с острым холодовым стрессом (средние зна- чения log - 9*7±0.76; р=О.6ОЗ критерий Стьюдента)* то есть введение бутоксиэтанола провоцирует развитие аутоиммунной реакции* направленной в отношении собственных эритроцитов* При этом в группе с сочетанием введения бутоксиэтанола и острым стрессом агглютинация более выражена, но эта разница статистически незначима.

При проведении реакции агглютинации с гетерологичными эритроцитами в группе контроля реакция была положительна со средними значениями log-2*5±1.3.

В основе патогенеза приобретенной токсической гемолитической анемии лежат два механизма - окислительный и иммунный* Основу окислительного механизма составляет повреждение структур эритроцита различными окислителями. При избытке окислителя исчерпываются ресурсы антиоксидантной системы эритроцита (нарушение синтеза NADPH₂ в пентозном цикле при ингибировании или недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и* как следствие* угнетение системы глютатиона* основного антиоксиданта эритроцита) к что приводит к усиленной продукции свободных радикалов внутри клетки. При этом возникает окислительная денатурация гемоглобина* перекисное окисление липидов мембраны и повреждение мембранных белков. Показателем нестойкости эритроцитов может быть проба осмотической резистентности - дефектные клетки лизируются при более низких содержаниях соли в растворе* чем нормальные эритроциты [Williams..*, 2010].

При моделировании приобретенной токсической гемолитической анемии путем введения лабораторным животным фенилгидразина было показано, что поврежденные окислителем эритроциты удаляются из кровотока с помощью аутологичных антител* Данные антитела в норме способствуют удалению стареющих эритроцитов за счет связывания с измененными участками мембраны* на которых произошла десиализация, деградация или агрегация транспортных белков и нарушение фосфолипидной асимметрии. Также эти изменения могут распознаваться непосредственно макрофагами или опосредованно, через связывание комплемента или аутоантител* Подобный механизм элиминации поврежденных эритроцитов наблюдается у пациентов с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [Hom, Bashair Gopas, 1991]. Также аутологичные антитела могут образовывать агрегаты с денатурированным гемоглобином* вызывая изменения мембранных структур. Подобным образом элиминируются эритроциты у пациентов с серповидноклеточной анемией [Kannan, Laboyka* Low* 1988; Horn* Bashan, Gopas, 1991]* Было показано [Ghanayem, Sanchez, Matthews* 1992], что стареющие эритроциты более чувствительны к действию 2-бутоксиэтанола* Исходя из этого* возможно предположить* что элиминация поврежденных 2-бутоксиэтанолом эритроцитов осуществляется с помощью нескольких механизмов*

Помимо окислительного механизма повреждения эритроцитов выделяют иммунный механизм повреждения. Выделяют несколько путей поражения эритроцитов при иммунной форме гемолитической анемии* Классификация механизмов вовлечения иммунной системы в патологический процесс основана на эффекторном механизме повреждения эритроцитов. Два из них (гаптеновый и не-оантигеный) характеризуются выработкой антител против токсического вещества. При аутоиммунной форме продуцируются аутоиммунные антитела к антигенам эритроцита. В литературе описаны случаи выработки аутоантител к антигенам эритроцитов при приеме лекарственных средств* в частности а-метилдофы. Было показано* что данный препарат является сильным иммунорегулятором, который стимулирует выработку интерферона-у Т-клетками (Thl-, NK-* NKT-клетками* цитотоксическими Т-лимфопитами), усиливает синтез IgG В-клетками* пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов* направляет дифференцировку Т-хелперов по пути Thl* снижает функции Т-супрессоров и вызывает продукцию антител против Rli-антигенов [Baier. Poehla и* 1994]* Однако по литературным данным* длительное поступление в организм 2-бутоксиэтанола не приводит к увеличению продукции антител* интерферонов и интер-лейкина-2 [ExonelaL, 1991].

При проведении реакции агглютинации с гетерологичными эритроцитами в группе контроля реакция была положительна в половине случаев (средние значения log - 2*5±1.3). Иммунологические исследования аутбредной линии лабораторных крыс показали, что особи в большинстве обладают генетической идентичностью и гомозигот-ностью, в частности имеют одну группу крови* Таким образом, можно объяснить отсутствие агглютинации эритроцитов [Baker, Lindsey* Weisbrolh, 1979].

Выводы

• 1.    При экспериментальном моделировании приобретенной токсической гемолитической анемии путем интраперитонеального введения животным 2-бутоксиэтанола отмечается появление аутоантител к эритроцитам; титр антител нарастает при сочетании введения 2-бутоксиэтанола и острого стресса.

• 2,    Иммунологические исследования аутбредной популяции лабораторных крыс показали, что особи в большинстве обладают генетической идентичностью и ГОМОЗИГОТНОСТЬЮ* в частности имеют одну группу крови.