Иммуномодулирующая активность циклоферона у больных церебральной глиомой до операции и в отсроченном периоде после хирургического лечения

В настоящее время описаны изменения параметров иммунной системы у больных первичной опухолью головного мозга [1, 3–6]. Установлена недостаточность иммунной защиты у пациентов не только в периоде клинической манифестации опухоли головного мозга, но и в периоде ремиссии после хирургической редукции опухоли, а также при рецидивном росте. При этом выявлены показания к применению активаторов иммунного ответа [4].

В связи с угнетением звеньев противоопухолевого иммунитета изучено влияние интерферо-ногена – Циклоферона (НТФФ «Полисан», РФ) у нейроонкологических больных на разных этапах опухолевого процесса. Работы, посвящённые указанной проблеме, единичны; в большинстве из них используют в качестве иммуностимулятора экономически труднодоступный препарат интерлейкин-2 [3, 5, 8, 9].

Материал и методы

У 29 пациентов по данным клиниконеврологического обследования и МРТ диагностирована церебральная глиома различной степени злокачественности в полушарии головного мозга. В последующем характеристика новообразования уточнена при хирургическом удалении опухоли и гистологическом исследовании.

Оценка иммунного статуса включала исследование количества CD3⁺-лимфоцитов, а также определение содержания и соотношения СD4⁺ и СD8⁺ клеток. В работе определяли число СD20⁺ СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. №2 (44)

лимфоцитов в сочетании с оценкой в сыворотке крови уровней иммуноглобулинов A, M , G и концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). На лимфоидных клетках исследовали экспрессию маркёра CD25. Состояние врожденного иммунитета оценивали по степени фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) и тесту с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Кроме этого, определяли содержание CD16+ клеток. На иммунокомпетентных клетках исследовался маркер апоптоза CD95+. В сыворотке крови определялся базальный уровень ряда цитокинов – ИФН-α и ИФН-β, ФНО-α, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6.

Оценка иммунного статуса у больных проводилась на 3 этапах:

• 1)    до операции, в манифестной стадии растущей опухоли мозга;

• 2)    спустя 6 мес после субтотальной резекции глиомы, с достижением клинической и МРТ ремиссии;

• 3)    через 9 и более мес после хирургического лечения, в стадии рецидивного роста новообразования, подтверждённого нейровизуализацией.

В связи с выявленными фоновыми признаками иммунодефицита на каждом из этапов больным проводилось курсовое лечение Циклофероном – стимулятором синтеза интерферонов у человека, с контролем состояния иммунограммы до и после применения препарата. Базовая схема состояла из 10 внутримышечных инъекций иммуномодулятора в течение 21 дня. Динамика показателей иммунограмм в группах пациентов оценивалась статистически с расчётом средних величин и средней ошибки, проведением множественных сравнений по Шеффе и корреляционного анализа.

Результаты и обсуждение

Эффективность циклоферона у 29 пациентов, обследованных в манифестной фазе заболевания, характеризовалась следующими сдвигами в иммунном ответе (табл. 1). После применения Циклоферона в иммунограмме отмечено достоверное снижение содержания Т- лимфоцитов, на 14 % от исходного уровня), а также прослеживалась тенденция к понижению числа Т-хелперов и величины коэффициента CD4/CD8.

В гуморальном звене иммунитета после курсовой терапии циклофероном при незначи- тельных колебаниях числа В-лимфоцитов наблюдался достоверный подъём концентрации иммуноглобулинов A, M и G – на 118, 127 и 115 % от исходного уровня соответственно. Это можно интерпретировать как следствие усиления антителообразования, связанного с повреждением гематоэнцефалического барьера опухолью и контактом иммунокомпетентных клеток крови с опухолевыми и мозговыми антигенами у нейро-онкологических больных. У пациентов выявлено снижение на ¼ концентрации ЦИКов, а также числа клеток с маркером апоптоза CD95+ (Аро 1). При анализе факторов врожденного иммунитета обращало внимание низкое содержание естественных киллеров (СD16+) с сохранением фагоцитарной активности нейтрофилов и их микробицидности.

Концентрация цитокинов после введения интерфероногена характеризовалась тем, что наблюдался прирост более чем в 2 раза уровня ИЛ-2, стимулирующего пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов и активирующего преимущественно киллерный механизм иммунитета за счёт возрастания активности NK. В то же время блокировался синтез ИЛ-4 и угнеталось образование ИФН-α.

Суммируя влияние циклоферона на стадии клинической манифестации растущей церебральной глиомы у больных, следует подчеркнуть возрастание в ответ на иммуномодуляцию в регуляторном звене иммунитета содержания ИЛ-2, определяющего выбор клеточного иммунного ответа, составляющего основу противоопухолевого иммунитета. После курса иммунотерапии не наблюдалось положительной динамики численного состава СD4+ и СD8+ лимфоцитов; более чем в 3 раза снижено содержание СD16+ клеток, также оставался низким уровень ФНО-α. Интересно, что в наблюдаемой группе больных не отмечено прироста в сыворотке крови уровня исследуемых интерферонов, хотя в основном циклоферон рассматривается как индуктор интерферона. Возможно, что пониженный ответ на иммуностимуляцию играет предрасполагающую роль в инициации опухолевого процесса.

Ремиссия роста опухоли у больных церебральной глиомой достигалась при максимально возможной циторедукции массы новообразования, дополненной при показаниях лучевой терапией

Таблица 1

Динамика иммунитета после курсового назначения у больных ОГМ на разных стадиях заболевания

Показатель иммунограм	Здоровые лица	Параметры иммунограммы у больных ОГМ на этапах
		до операции		после удаления глиомы – ремиссия		после операции – рецидив глиомы
		1	2	1	] 2	1	2
Клеточный иммунитет
Лимф., абс	1,83±0,051	2,3±0,87	2,2±0,77	2,12±014	1,74±0,11*	1,98±0,18	1,61±0,11*
Т-лимф,,абс	1,35±0,03	1,5±0,59	1,3±0,61*	1,34±0,08	1,1±0,07*	1,15±0,1	1,06±0,08
СD4+, %	48,7±1,05	41,6±7,53	40,7±6,74	37,0±1,67	36,1±1,12	35,2±2,19	37,8±1,45
Т-хелп., абс	0,83±0,02	1,0±0,47	0,8±0,46	0,76±0,05	0,62±0,04*	0,68±0,06	0,62±0,05
СD8+%	27,8±0,76	24,6±6,41	24,8±4,85	25,0±1,39	26,8±0,77	20,9±1,5	25,8±0,99*
Т-супр., абс	0,514±0,01	0,5±0,22	0,5±0,20	0,52±0,04	0,48±0,03	0,42±0,03	0,45±0,04
Тх /Тс	1,65±0,05	1,9±0,74	1,8±0,53	1,55±0,08	1,36±0,04*	1,67±0,09	1,60±0,08
Гуморальный иммунитет
В-лимф., абс	0,22±0,01	0,2±0,15	0,2±0,11	0,20±0,02	0,23±0,05	0,15±0,03	0,17±0,03
СD20+, %	26,9±0,86	10,2±8,24	9,3±5,77	9,67±1,36	10,9±0,98	10,0±1,68	10,0±1,25
Ig A, г/л	2,1±0,09	1,7±0,81	2,0±0,86*	2,02±0,2	1,88±0,13	2,72±0,28	2,48±0,19
Ig M, г/л	1,17±0,07	1,5±0,52	1,9±0,59*	1,52±0,16	1,9±0,11*	1,65±0,12	1,94±0,15*
IgG, г/л	11,1±0,26	10,2±1,86	11,8±1,79*	11,4±0,5	12,1±0,3	10,1±0,85	12,1±0,46*
Активационные маркёры
СD25+, %	24,6±0,77	0,7±0,75	0,7±0,52	0,57±0,17	0,47±0,16	0,33±0,12	0,23±0,09
СD95+, %	28,5±2,03	45,2±6,15	40,6±5,26*	41,9±1,8	38,8±1,65	37,3±1,79	40,5±1,75
Неспецифическая резистентность
ЦИК, ед.	28,9±3,39	66,2±21,9	50,0±18,7*	85,0±4,8	80,7±6,1	83,3±7,65	80,5±7,25
НТС-тест, %	6,21±0,22	4,9±1,33	5,0±1,47	5,57±0,46	5,25±0,38	6,49±0,53	5,58±0,40*
ФАН, %	78,8±1,53	69,4±13,4	73,1±9,78	69,5±2,85	66,9±3,2	69,8±73,2	73,2±3,1
СD16+, %	35,3±1,33	10,0±3,36	10,4±3,44	9,38±0,88	12,0±-,89*	8,52±0,75	10,8±0,79*
Цитокиновый статус
ИФН-α, пкг/мл	1,76±1,89	9,4±17,5	6,3±7,13	3,59±0,66	3,68±0,9	3,18±0,74	4,64±1,18
ИФН-γ, пкг/мл	7,72±0,675	12,3±12,5	12,8±10,5	20,6±3,07	15,8±2,1*	18,1±2,98	17,0±2,17
ФНО-α, пкг/мл	4,98±0,437	2,3±2,44	1,9±1,88	1,39±0,52	2,5±0,68*	2,51±1,22	4,42±1,6*
ИЛ-2, пкг/мл	11,9±0,931	32,6±58,07	70,9±75,9*	33,3±9,59	45,1±8,17	35,8±9,2	45,1±6,88
ИЛ-4, пкг/мл	10,7±0,76	48,8±56,3	32,5±46,01	29,4±15,8	21,8±10,4	28,8±12,9	37,1±12,5
ИЛ-6, пкг/мл	7,76±0,48	6,2±2,96	6,7±3,98	9,73±2,23	8,99±2,0	9,73±2,35	6,71±1,09

Примечание: 1 – фоновая иммунограмма до лечения Циклофероном; 2 – иммунограмма после курсового назначения Циклоферона.

ложа опухоли. Ремиссия доказывалась у больных стойким (не менее 6 мес) регрессом клинических проявлений – общемозговых симптомов и частично очаговой неврологической симптоматики. Контрольное МРТ исследование указывало на отсутствие объёмного очага и положительного «масс-эффекта» в головном мозге. Из 29 больных иммунологическое исследование проведено у 21

пациента (8 больных выбыли из исследования по разным причинам). В связи с сохранением у больных признаков иммунодефицита, характерных для периода клинической фазы роста опухоли, и для повышения уровня противоопухолевой защиты у них – проведён 2-й курс циклофе-ронотерапии с заключительным контролем иммунологического статуса (табл. 1).

При этом отмечено достоверное снижение количества CD3+- и CD4+ -лимфоцитов, а также величины иммунорегуляторного индекса. В звене гуморального иммунитета значимо повысилось содержание IgM, на фоне статистически недостоверных колебаний уровней других иммуноглобулинов. В ответ на проведение курса циклоферона на 26 % возросло содержание естественных киллеров (СD16+), играющих важную роль в разрушении опухолевых клеток-мишеней. В регуляторном звене иммунной системы у больных произошло понижение содержания ИФН-γ и одновременно рост концентрации ФНО-α.

Таким образом, у пролеченных больных при достижении устойчивого равновесия (в периоде стабилизации опухолевого процесса) сохранялись признаки вторичной иммунной недостаточности, близкие по своей структурной направленности к дооперационному уровню. Проведение 2-го курса Циклоферона было направлено на упрочение фазы ремиссии.

Ответная реакция иммунной системы на введение индуктора интерферона включала разнонаправленные сдвиги компонентов иммунной защиты – снижение уровня провоспалительного ИФН-γ и одновременно повышение содержания ФНО-α., каждый из которых усиливает цитотоксическую деятельность киллеров. Позитивным явлением был прирост содержания естественных киллеров (СD16+), принимающих участие в разрушении опухолевых клеток и усилении их апоптоза. Абсолютное содержание СD3+ лимфоцитов в конце курса терапии Циклофероном снижалось. В этой связи можно отметить, что полной нормализации картины иммунограммы у больных не наблюдалось, что требует, очевидно, повторных курсов активизации иммунной защиты для удлинения периода ремиссии при опухоли мозга. Стойкость изменений иммунного статуса, возможно, вызвана нарушением нейро-иммунных взаимоотношений в силу первичной локализации новообразования в головном мозге, проведенным хирургическим вмешательством, а также комбинированным лечением (операция и лучевая терапия) у отдельных больных.

Возобновление прогрессии сохранившихся в мозге опухолевых клеток приводило вновь к повышению внутричерепного давления, психи- ческому угнетению пациентов, сужению сознания и апатии, появлению у них головной боли, рвоты и усилению очаговой неврологической симптоматики. На МРТ в динамике определялось нарастание объёма опухолевой массы, перифокальный отёк мозгового вещества, латеральное смещение мозга. При рецидиве церебральной глиомы возникала фоновая глобальная супрессия иммунной защиты, с вовлечением всех звеньев иммунитета (табл. 1).

Произведена попытка коррекции иммунного статуса у 21 пациента с помощью циклофе-ронотерапии с изучением иммунограммы до и после применения препарата. В ответ на иммуномодуляцию в клеточном звене иммунитета отмечалось некоторое повышение относительного содержания CD8+ лимфоцитов, а также отмечалось недостоверное повышение числа СD16+ клеток, уровней Ig M и IgG. Происходило угнетение микробицидной функции нейтрофилов и неоднозначные колебания содержания исследуемых цитокинов со статистически достоверным снижением уровня ФНО-α.

В целом, на стадии декомпенсации опухолевого процесса отсутствие ответа иммунной системы на препарат можно считать признаком выраженной иммуносупрессии, обусловленной сочетанием ряда факторов: ослабления нейро-регуляторного влияния на иммуногенез, супрессивного влияния самой опухоли на иммунную систему, наличия интоксикации, стресса и т.д. По мнению некоторых авторов [2], на стадии ресинтеза опухолевой массы иммуностимуляция может обусловить парадоксальную реакцию иммунитета и даже участие иммунной системы в прогрессировании процесса.

Для наглядного сравнения перестройки иммунитета в ответ на курсовое применение Циклоферона в разные периоды развития неоплазмы вычислен относительный уровень модификации параметров иммунограммы (табл. 2). Показано, что на дооперационном этапе у больных изменения модулированного иммунитета проявлялись преимущественно повышением концентрации иммуноглобулинов G, A, M и уровня ИЛ-2. В периоде ремиссии после хирургического субтотального удаления опухолевой массы наблюдалось снижение содержания Т-лимфоцитов, при повышении про-

Таблица 2

Модификация параметров иммунитета после курса иммуномодуляции в сравнении с фоновой иммунограммой у больных с опухолью мозга

Показатели	До операции	После операции – ремиссия	После операции – рецидив
Общ. число лимфоцитов	-	82,0 %	81,3 %
Число Т-лимфоцитов (абс,)	86,6 %	82,1 %	-
Т-хелп. (абс,)	-	-	-
Тхелп. /Тсупр. (%)	-	87,7 %	-
СД3	-		110,4 %
СД8	-		123,4 %
IgA	117,6 %		-
IgM	126,6 %	125,0 %	117,5 %
Ig G	115,6 %	-	119,8 %
ЦИК	75,5 %	-	-
НТС-тест	-	-	85,9 %
СД16	-	127,9 %	126,7 %
СД95	89,8 %	-	-
ИФН-γ	-	76,6 %	-
ФНО-α	-	179,8 %	176,0 %
ИЛ-2	195,8 %	-	-

Примечание: в таблице представлены только статистически значимые сдвиги показателей иммунитета (р<0,05) после курсового назначения Циклоферона.

цента СD16+ клеток и уровня ФНО-α.

На фоне рецидивного роста глиомы стимуляция иммунитета приводила к умеренному количественному приросту субпопуляций Т-клеток, уровней иммуноглобулинов, числа естественных киллеров и концентрации ФНО-α. Однако эти сдвиги происходили на фоне низких исходных параметров Т-клеточного иммунитета. Поэтому относительный прирост отдельных компонентов иммунной системы, в частности СD8+, СD16+ лимфоцитов и уровня ФНО-α, можно расценить как неэффективный и истощающий. Таким образом, восстановления регуляторных связей цитокинов и клеточноопосредованного иммунного ответа на фоне терапии Циклофероном у больных не происходило.

Оценка иммунного статуса у больных ОГМ на различных этапах развития новообразования свидетельствовала о наличии у них фонового состояния иммунодефицита [4], что обусловливало показания к проведению иммуностимулирующей терапии и активизации противоопухолевой защиты. Из доступной нам литературы известны положительные результаты применения рекомбинантного препарата интерлейкина-2 у больных раком II–III стадии молочной железы, желудочно-кишечного тракта и других локализаций [7, 8]. При церебральных новообразованиях, в основном при глиобластомах, также имеются единичные публикации успешного применения иммунотерапии ИЛ-2 [3, 5, 9].

Нами использован более доступный отечественный препарат со свойствами интерферо-ногена – Циклоферон (НТФФ «Полисан», РФ), обладающий свойством усиливать противовирусный иммунитет [4]. Выяснилось также, что он оказывает стабилизирующее влияние после курсового применения у больных с развивающейся опухолью головного мозга (до проведения радикального лечения). Это подтверждалось данными МРТ и клиническими наблюдениями пациентов на протяжении 6 мес, а также нахождением у них умеренных позитивных сдвигов показателей иммунной защиты [4].

В настоящем исследовании изучен эффект применения Циклоферона в разные сроки развития церебральных глиом – в манифестной стадии новообразования (сразу после комплексной диагностики клинических данных и нейровизуализацией головного мозга), а также после проведения хирургической циторедукции опухоли (у некоторых пациентов дополненной лучевой терапией), в том числе при достижении стойкой ремиссии и при последующем рецидивном росте неоплазмы. Это позволило судить об эффективности Циклоферона в разные стадии заболевания и при разной степени компенсации пациентов.

Результаты исследования показали, что в ответ на иммуномодуляцию у больных в манифестной фазе опухолевого роста, несмотря на возрастание в сыворотке крови базального уровня ИЛ-2, количество клеток Т-ряда оставалось сниженным, не отвечая на стимуляцию регуляторного звена иммунной системы.

На этапе достигнутой стойкой ремиссии, спустя 6 мес после субмаксимальной резекции ткани опухоли проведение курсового лечения Циклофероном характеризовалось повышением уровня ФНО-α, играющего значимую роль в противоопухолевом иммунитете. Одновременное снижение концентрации ИФН-γ, возможно, отражает уменьшение остроты аутоиммунных и иных воспалительных реакций, сопровождающих активный рост новообразования и повреждение перифокальной мозговой ткани и гематоэнцефалического барьера. Позитивным явлением явилось увеличение числа естественных киллеров (СD16+), обладающих выраженным цитолитическим эффектом по отношению к опухолевым клеткам-мишеням. В то же время число Т-лимфоцитов не только не повышалось, но даже имело тенденцию к статистически незначимому понижению. Таким образом, перестройка иммунного статуса на этапе ремиссии опухолевого процесса у больных была достаточно торпидна (возможно, вследствие перенесенной операции и у некоторых пациентов комбинированной с лучевой терапией). Скорее всего, на этом этапе требуется проведение повторных курсов иммунотерапии для упрочения состояния компенсации.

На фоне рецидивного роста опухоли, в периоде декомпенсации больных попытка до- биться улучшения иммунологического статуса Циклофероном привела к умеренному росту количества субпопуляций Т-клеток, концентрации иммуноглобулинов, числа натуральных киллеров и уровня ФНО-α. Эти сдвиги происходили на фоне исходно низких показателей клеточного иммунитета и содержания цитокинов и поэтому не приближались к нормативным значениям иммунограммы. Поэтому можно предвидеть, что в стадии декомпенсации нейроонкологических больных иммуномодуляция способствует лишь кратковременному подъёму пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток. Подтверждением этому является отсутствие векторной направленности синтеза цитокинов, динамика концентрации которых не имела строгой закономерности, а носила хаотический характер, не совпадая с ожидаемой тенденцией нормализации показателей иммунограммы.

Заключение

Иммуномодуляция нейроонкологических больных Циклофероном в базовой дозировке проявляется изменениями преимущественно в цитокиновом статусе, а также положительными сдвигами показателей гуморального звена иммунитета и неспецифических факторов защиты. В то же время восстановления исходно низких показателей Т-клеточного звена иммунитета не происходило.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у нейроонкологических больных на разных этапах развития церебральной глиомы наблюдается снижение (или разобщение) регуляторного влияния цитокинов на периферическое звено иммуногенеза, которое не восстанавливается в ответ на курсовую терапию Циклофероном. Это выражалось в отсутствии изменений или парадоксальном снижении содержания Т- и В-лимфоцитов, несмотря на повышение уровня регуляторных цитокинов. Наиболее значимый ответ на применение индуктора интерферонов происходил у больных в фазе клинико-МРТ ремиссии опухолевого процесса, в сравнении с манифестной фазой опухолевого развития и стадией рецидивного роста.