Иммунопротективное действие рекомбинантного колицина Е2 на модели пневмонии вирусного генеза у белых мышей

Антропогенное воздействие на экологию планеты приводит к ускорению изменения генома вирусов. Такая ситуация создает угрозу возникновения сложноконтролируемых эпидемических и эпизоотических процессов.

Возбудители аденовирусной инфекции обладают высокой скоростью репликации, выраженной латенцией, способностью связываться с белками крови, что ведет к угнетению гуморального и клеточного иммунитета и достоверно подтверждается высокими показателями заболеваемости людей и животных при мониторинге вирусных заболеваний [1, 2].

Аденовирусы, в силу своего филогенетического развития, обладают высокой устойчивостью к химическим детергентам и длительно сохраняются во внешней среде [3]. Широкое применение в лечебной практике синтезированных лекарственных препаратов вызывает появление резистентных вариантов аденовирусов, обусловленных изменениями тиамидинкиназы и ДНК-полимеразы пораженных клеток [4].

Некоторые варианты аденовирусов все чаще приобретают устойчивость к интерферонам путем генной мутации или ингибированием передачи сигналов интерферона после связывания его с рецептором [5].

Большинство противовирусных препаратов, несмотря на достаточно высокую терапевтическую эффективность обладают нефротокичностью, гепатотоксичностью, кардиваскулярной токсичностью и другим побочным действием [6].

В связи с этим, изучение новых препаратов для снижения репликации аденовирусов и исследование ответных реакций иммунитета на моделях in vivo может по- мочь в объяснении некоторых аспектов иммунопатогенеза аденовирусных инфекций.

Целью работы являлось изучение им-мунопротективного действия рекомбинантного колицина Е2 (патент №2188233 от 2708.2002, ТУ 9337-010-00008064-01) на модели пневмонии вирусного генеза у белых мышей.

Материалы и методы

Иммунопротективное действие рекомбинантного колицина Е2 (Rec ColE2) исследовали на модели пневмонии вирусного генеза у белых мышей.

Были сформированы три группы из нелинейных белых мышей-самцов с массой тела 25,0±1,0 г по 10 животных в каждой группе. Животных содержали при естественном режиме освещения и свободном доступе к воде и пище. Эксперименты выполняли в соответствие с международными рекомендациями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для исследований, от 18 марта 1986 года. Мыши первой (контрольной) интактной группы не подвергались манипуляциям. Животным второй и третьей (подопытных) групп интраназально вводили по 50 мкл на мышь раствора натриевой соли (20 мкг/мл) полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (Poly I:C), как индуктор воспаления вирусного генеза, способствующий возможности заражения мышей аденовирусом второго типа крупного рогатого скота. Через сутки мышам вышеуказанных групп интраназально в дозе 50 мкл на животное вводили вируссо-держащую суспензию аденовируса второго типа крупного рогатого скота, выделенного из экссудата носовой полости больного телёнка. Вирусосодержащая суспензия с инфекционной активностью 6,5 LgТЦД 50/мл на культуре клеток MDBK (Madin Darby Bull Kidney) в дозе 50мкл составляла 5LD 50 для беспородных белых мышей в присутствии полиинозиновой-полицитидиловой кислоты.

Через 24 часа после введения аденовируса второго типа (Adv2) животным третьей (подопытной) группы вводили Rec ColE2 внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл

(100 мкг Rec ColE2) один раз в сутки в течение 8 суток.

Наблюдение за белыми мышами осуществляли в течение 10 суток. Гибели среди переболевших мышей подопытных групп не отмечали.

После 10 суток мышей всех трех групп усыпляли декапитацией с взятием крови от каждого животного. Эритроциты в исследуемых пробах крови удаляли раствором BD FASK Lysin solution с последующим трехразовым отмыванием. Для иммунофе-нотипирования Т-лимфоцитов использовали моноклональные антитела меченые флюоресцеиномизотиоционатом к CD4 и CD85 (Caltag Inoitrogen) и к CD3, CD8 – фикоэритрином (BD Biosciences Farmingen). Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии на проточном цитометре Facs Calibur (Becton Dicrinson).

Количество цитокинов – интерлейкина-1β (Il-1β), интерлейкина-2 (Il-2), гамма-интерферона (IFN-γ), фактора некроза опухолей альфа (TNF-α) в крови мышей определяли методом иммуноферментного анализа диагностикумами Clon Cloud Co (США) и Cusabio Biotech Co (Китай) на иммуноферментном анализаторе Zenyth 340 (Anthos).

Количество дефензинов α1 (DEFα1), дефензинов β1 (DEFβ1) и легочного сурфактантного белка А (SP-A) в крови экспериментальных животных определяли методом ИФА диагностикумами Clon Cloud Co (США), Agilent Technologies (США).

Статистическую обработку данных проводили по программе Statistica [7].

Результаты и обсуждения

Известно, что Toll-подобные рецепторы (TLR) играют первичную роль в распознавании общих для всех патогенов молекул [8] Poly I:C, используемая в исследовании, как широко применяемый индуктор модели вирусного воспаления взаимодействовала в клетках с Toll-подобными рецепторами TLR-3, вызывала повреждение эндотелия лёгких и альвеолярной ткани и включал воспалительную реакцию. Действие Adv2 усиливало провоспалительный эффект с нарушением клеточно- опосредованного иммунитета. Происходило разрушение эндотелия и альвеол лёгких, с высвобождением в кровеносные сосуды сурфактантного белка S-PA, обладающего способностью стимулировать хемотаксис фагоцитов и продукцию провос-палительных цитокинов, что подтверждалось пятикратным повышением количества S-PA в крови белых мышей второй (подопытной) группы по сравнению с показателями S-PA в крови мышей первой (контрольной) интактной группы (таблица).

Через 10 суток заражения в крови животных второй (подопытной) группы отмечали значительное повышение Т-хелперов CD4+ 22,76±0,58, по сравнению с 3,24±0,62 CD4+ первой (контрольной) группы, что вызвало повышение IFN-γ и IL2 в крови мышей второй подопытной группы на 50%, по сравнению с показате- лями интерферона первой (контрольной) интактной группы. Повышение IFN-γ и IL2 связано с воздействием на клетки-мишени CD4+ и ингибированием вирусной репликации.

Значительное возрастание количества CD8+ и СД25+ в крови зараженных белых мышей второй (подопытной) группы рассматривалось, как попытка компенсации и адаптации организма к воспалительному процессу за счёт тимацитов и зрелых Т-лимфоцитов (таблица). Повышение в крови CD3+ лимфоцитов указывало на остроту процесса и усиление цитоксичности к пораженным клеткам. Также отмечали увеличение количества провоспалительного интерлейкина IL-1β, запускающего каскад цитокиновых реакций связанный с разрушением клеток бронхиального эпителия и альвеолоцитов второго типа.

Таблица 1. Изучение влияния рекомбинантного колицина Е2 на клеточный иммунитет в модели вирусной пневмонии у белых мышей

Показатели	Первая группа n=10 контрольная интактная	Вторая группа n=10 подопытная Poly I:C+Adv2	Третья группа n=10 подопытная после курса Rec ColE2
CD3+(106/мл)	3,86±0,54	14,8±0,18*	5,05±0,46**
CD4+(106/мл)	3,24±0,62	22,76±0,58*	4,26±0,35**
CD8+(106/мл)	2,32±0,12	16,24±0,88*	3,42±0,82**
CD25+(106/мл)	0,24±0,04	4,19±0,27*	0,36±0,18**
IL-1β(пг/мл)	154,2±16,9	610,5±11,8*	137,9±8,12**
IL-2(пг/мл)	520,4±21,5	1140,8±14,2*	630,4±15,8**
IFN-γ(пг/мл)	824,5±11,84	1245,9±12,5	955,8±19,5
TNF-α(пг/мл)	386,8±10,88	890,56±15,37*	420,5±9,88**
DEFα1(пг/мл)	41,4±7,25	590,4±18,25*	52,2±8,15**
DEFβ1(пг/мл)	28,8±5,16	340,8±21,2*	38,4±4,13**
SP-A(нг/мл)	14,5±0,28	72,5±1,24*	16,2±0,85**

* P<0,5 – по отношению к первой (контрольной) интактной группе;

** P<0,5 – по отношению ко второй (подопытной) группе.

Активация пролиферации иммунофер-ментных клеток и увеличение синтеза IFN-γ и фактора некроза опухоли TNF-α в крови мышей второй (подопытной) группы под воздействием Poly I:C и Adv-2 индуцировали повышенную экспрессию DEFα1 и DEFβ1. Дефензины этих структурных групп блокировали вирусные рецепторы и взаимодействовали с инфицированными альвеолоцитами и клетками бронхиального эпителия. Но увеличение их количества в крови белых мышей второй подопытной группы не повлияло на развитие вирусного процесса (таблица).

В крови животных третьей подопытной группы после 8-дневного курса внутрибрюшинных инъекций Rec ColE2 отмечали нормализацию количества CD4+, CD8+ и CD3+ в связи с подавлением инфекционнотоксического синдрома и снижением про-ливерации Т-лимфоцитов в кровяные сосуды [9, 10, 11]. Известно о Tol-зависимой системе транслокации у колицинов и сходстве действия колицинов с механизмом действия фагов [12, 13]. Есть вероятность, что при воздействии Rec ColE2 на проницаемость альвеолоцитов и эпителиальных клеток дыхательного тракта и активации TLR-системы, повышалась возможность распознавания генома Adv-2. Кроме того, Rec ColE2 активировал DEFα1, который ингибировал аденовирус, предотвращал раскрытие вируса и высвобождение эндосомального белка IV во время проникновения в клетку. При этом связывание дифензина с участием капсида вируса в области пептонов, блокировало этапы снятия покрытия для высвобождения белка VI аденовируса [14]. В дальнейшем количество DEFα1 и DEFβ1 приходили в физиологическую норму (таблица). В крови животных третьей подопытной группы отмечали снижение количества CD25+ и, соответственно, снижение экспрессии противовоспалительных цитокинов IL-2 и TNF-α. На значительное снижение вирусной репликации у белых мышей третьей подопытной группы указывало 57%-ное снижение количества IFN-γ по сравнению с данным показателем во второй подопытной группе.

Заключение

В результате выполненных исследований установлено, что при поражении организма белых мышей при интраназальном введении Poly I:C и Adv-2 на 11-й день эксперимента отмечалось резкое повышение Т-лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+ и CD25+ в виде ответной реакции клеточного иммунитета. Повышение противовоспалительных цитокинов IL-1β, IL-2, IFN-γ и TNF-α указывало на острый воспалительный процесс вирусного генеза. Повышение SP-A в крови зараженных белых мышей указывало на разрушение клеток бронхиального эпителия и альвеолоцитов.

Значительное увеличение количества DEFα1 и DEFβ1 отражало активную противовирусную дефензиновую защиту организма при заражении Adv-2.

Отмечалось выраженное иммунопро-тективное действие Rec ColE2 на клеточный иммунитет белых мышей после инъекционного курса. В ходе исследований установлена нормализация показателей CD Т-лимфоцитов различных популяций и соответствующее снижение количества в крови экспериментальных мышей провос-палительных цитокинов до уровня значений интактных животных.

Отмечалась активация Rec ColE2 дефензинов DEFα1 и DEFβ1, свидетельствующая об их роли в подавлении вирусного процесса.

Полученные результаты подтверждают достоверное влияние Rec ColE2 на активацию клеточного иммунитета у белых мышей при вирусном заражении Adv-2.