Иммуновоспалительные механизмы старения мочевого пузыря

экспериментальная и клиническая урология № 4 2023

Старение представляет собой одно из самых сложных биологических явлений, которое затрагивает все органы и системы организма человека, в том числе мочевыделительную. В настоящее время не существует единой общепризнанной теории старения,и точные патофизиологические механизмы сенесценции мочевого пузыря еще предстоит выяснить. При этом накапливающиеся научные данные свидетельствуют о том, что старение тесно связано с хроническим низкоуровневым воспалением (low-grade inflammation) [1, 2]. Данная теория воспалительного старения (inflameaging) позволяет по-новому взглянуть на процесс се-несценции. Она подразумевает формирование фенотипа хронического воспаления, сопровождающегося хронической активаций оксидативного стресса и выработкой воспалительных/профибротических цитокинов, в итоге приводящих к развитию фиброзной трансформации тканей (фиброз-опосредованное старение), а на клиническом уровне проявляющегося функциональным дефицитом органов [1, 3].

Цель. Изучить роль свободно-радикального окисления, эндотелиальной дисфункции и низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления как потенциальных факторов клеточной сенесценции в процессе возрастной перестройки детрузора у экспериментальных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными,принятыми «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей», «Федерацией европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных» и «Международным советом по науке о лабораторных животных». Исследования были разрешены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (протокол №57 от 19.09.2022 года). Использовались 20 беспородных половозрелых здоровых белых крыс (10 самок и 10 самцов) массой тела 180-200 граммов. Группу 1 (старые животные) составили 10 (5 самок и 5 самцов) белых крыс. Выведение из эксперимента, декапитация и забор биологического материала у них выполнялись в возрасте 30 месяцев с последующим исследованием периферической крови и гомогенатов мочевого пузыря. Группу 2 (молодые животные) составили 10 белых крыс (5 самок и 5 самцов), не подвергавшихся никаким экспериментальным воздействиям. Декапитация и забор биологического материала у них производились в возрасте 10 месяцев.

В качестве маркеров низкоуровневого возраст-ас-социированного воспаления использовали: Фактор некроза опухолей альфа, ФНО-α (Rat Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF-α, ELISA Kit, Fine Biotech); Антагонист рецептора интерлейкина-1, АР ИЛ-1 (Rat Interleukin 1 receptor antagonist, IL1RA, ELISA kit, Cusabio); Интерлейкин-6, ИЛ-6 (Rat Interleukin 6, IL-6, ELISA kit, Cusabio). В качестве маркеров эндотелиальной дисфункции использовали: Эндотелин-1, ЭТ-1 (Rat En-dothelin 1, ET-1, ELISA kit, Cusabio); Специфическая молекула эндотелиальных клеток-1, СМЭК-1 (Rat Endothelial Cell Specific Molecule 1, ESM1, ELISA kit, Fine Biotech); Интерлейкин - 1 бета, ИЛ-1 бета (Rat Interleukin 1β, IL-1β, ELISA kit, Cusabio). В качестве маркеров фибропластической трансформации (профибротиче-ские цитокины) использовали: Трансформирующий ростовой фактор бета-1, ТРФ бета-1 (Rat Transforming Growth Factor β1, TGF-β1, ELISA kit, ELISA kit, Cusabio); Фактор роста соединительной ткани, ФРСТ, (Rat connective tissue growth factor, CTGF, ELISA Kit, Puda Scientific). Для оценки маркеров свободнорадикального окисления выполняли определение уровней: 8-изопро-стана (методом иммуноферментного анализа, ELISA, производитель Cayman, США), малонового диальдегида (по методу Стальной И.Д. и Гаришвили Т.Г., 1977) [4], каталазы (по методу Aebi, 1984, модифицированного Королюком М.А. и Ивановой Л.И., 1988) [5], а также диеновых конъюгатов (по методике И.Д. Стальной, 1977) ) [6]. Статистическая обработка полученных результатов проводилась по двум группам с помощью пакета программ STATISTICA 10.0 (data analysis software system, StatSoft Inc, 2011). Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводился с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Для описания нормально распределенных количественных признаков было использовано среднее значение признака и среднее квадратичное отклонение. Для сравнения двух групп с нормальным распределением применялся критерий Стьюдента. Различия и взаимосвязи между признаками считали достоверными при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведена сравнительная оценка статуса низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления (TNF-α, IL-6, IL1RA) в крови и гомогенате стенки мочевого пузыря в группах молодых и старых животных. Результаты раздельного изучения показателей цитоки-нового статуса представлены в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, средние значения всех показателей низкоуровневого возраст-ассоциирован-ного воспаления, определяемые в крови у старых животных (группа 1), были значительно выше в сравнении с группой молодых животных (группа 2)и во всех случаях достигали статистически значимого уровня различия (p<0,05). Отметим, что по некоторым показателям превалирование над группой контроля составляло более 3-х раз. Выявлена аналогичная статистически достоверная разница между группами молодых и старых крыс по показателям низкоуровневого воспаления гомогената мочевого пузыря.

При анализе статуса эндотелиальной дисфункции крови у экспериментальных животных выявлено,что средние значения всех изучаемых маркеров эндотелиальной дисфункции (ET-1, IL-1β, ESM1), определяемые в крови у старых животных (группа 1), также значительно превышали аналогичные показатели в группе молодых животных (группа 2), во всех случаях достигая статистически значимого уровня различия ( p <0,05). Данная статистически значимая разница между группами старых и молодых крыс по исследуемым маркерам (ET-1, IL-1β, ESM1) также наблюдалась при исследовании гомогената стенки мочевого пузыря (табл. 2).

Таблица 1. Маркеры низкоуровневого возраст-ассоциированного воспаления крови и гомогенате стенки мочевого пузыря

Table 1. Markers of low-level age-associated inflammation in the blood and bladder wall homogenate

Изучаемый показатель The indicator being studied	Группа 1, (n=10) Group 1,(n=10) M±SD	Группа 2, (n=10) Group 2,(n=10) M±SD	p
Периферическая кровь (пг/мл) Peripheral blood (pg/ml)
Фактор некроза опухолей-альфа (TNF-α) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)	54,5±13,4	21,8±3,4	0,03
Интерлейкин- 6 (IL-6) Interleukin-6 (IL-6)	3,9±0,3	1,03±0,1	<0,01
Антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL1RA) Interleukin-1 receptor antagonist (IL1RA)	222,9±25,2	135,4±23,8	0,02
Гомогенат стенки мочевого пузыря (пг/мл) Bladder wall homogenate (pg/ml)
Фактор некроза опухолей-альфа (TNF-α) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)	45,7±5,7	16,8±2,5	<0,01
Интерлейкин- 6 (IL-6) Interleukin-6 (IL-6)	4,9±0,4	1,1±0,2	<0,01
Антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL1RA) Interleukin-1 receptor antagonist (IL1RA)	249,5±29,9	156,1±32,2	0,04

Таблица 2. Показатели статуса эндотелиальной дисфункции в группах эксперимента и группе контроля

Table 2. Indicators of endothelial dysfunction status in the experimental and control groups

Изучаемый показатель The indicator being studied	Группа 1, (n=10) Group 1,(n=10) M±SD	Группа 2, (n=10) Group 2,(n=10) M±SD	p
Периферическая кровь (пг/мл) Peripheral blood (pg/ml)
Эндотелин-1 (ET-1) Endothelin-1 (ET-1)	29,7±4,0	7,9±1,2	0,03
Интерлейкин – 1 бета (IL-1β) Interleukin – 1 beta (IL-1β)	443,1±47,9	171,5±66,5	<0,01
Специфическая молекула эндотелиальных клеток 1 (ESM1) Endothelial cell specific molecule 1 (ESM1)	674,4±101,9	245,4±52,1	<0,01
Гомогенат стенки мочевого пузыря (пг/мл) Bladder wall homogenate (pg/ml)
Эндотелин-1 (ET-1) Endothelin-1 (ET-1)	27,3±5,4	10,9±2,6	0,01
Интерлейкин – 1 бета (IL-1β) Interleukin – 1 beta (IL-1β)	675,2±44,1	147,5±39,5	<0,01
Специфическая молекула эндотелиальных клеток 1 (ESM1) Endothelial cell specific molecule 1 (ESM1)	782,0±92,3	283,1±72,6	<0,01

Анализ полученных данных показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ)и системы антиоксидантной защиты у экспериментальных животных показал, что молодые животные контрольной группы в норме имеют невысокие показатели ПОЛ, и, соответ-ственно,активности каталазы как сыворотки крови, так и мочевого пузыря, что свидетельствует о сбалансированности системы антиоксидантной защиты. Также показано, что средние значения продуктов ПОЛ, определяемые в крови у старых животных (группа 1), были значительно выше (для диеновых конъюгатов в 2 раза, для малонового диальдегида в 3,5 раза) в сравнении с группой молодых животных (группа 2) и во всех случаях достигали статистически значимого уровня различия (p<0,05). Одновременно с этим уро- вень каталазы был выше у старых животных в 1,5 раза как на системном, так и на органном уровнях (гомогенат мочевого пузыря) (табл. 3).

Анализ первичных данных раздельного изучения профибротического статуса - TGF beta 1 и CTGF (табл. 4), выявил, что средние значения всех изучаемых про-фибротических цитокинов, определяемых в крови у пожилых крыс (группа 1) были значительно выше в сравнении с группой молодых крыс (группа контроля) и во всех случаях достигали статистически значимого уровня различия ( p <0,05). В гомогенате мочевого пузыря зафиксирована аналогичная статистически достоверная разница между группами молодых и пожилых крыс по показателям профибротических цитокинов.

Таблица 3. Перекисное окисление липидов и системы антиоксидантной защиты крови и гомогената стенки мочевого пузыря

Table 3. Lipid peroxidation and antioxidant defense systems of blood and bladder wall homogenate

Изучаемый показатель The indicator being studied	Группа 1, (n=10) Group 1,(n=10) M±SD	Группа 2, (n=10) Group 2,(n=10) M±SD	p
Периферическая кровь (пг/мл) Peripheral blood (pg/ml)
Диеновые конъюгаты (ммоль/л) Diene conjugates (mmol/l)	49,3±7,1	24,5 ±6,6	0,02
Малоновый диальдегид (ммоль/л) Malondialdehyde (mmol/l)	60,4±9,3	21,4±4,2	<0,01
Активность каталазы(мкат/л) Catalase activity (mkat/l)	48,3±4,7	32,5±5,3	0,03
Гомогенат стенки мочевого пузыря (пг/мл) Bladder wall homogenate (pg/ml)
Диеновые конъюгаты (мкмоль/г ткани) Diene conjugates (mmol/g tissue)	56,3±10,2	25,7±7,2	0,03
Малоновый диальдегид (нмоль/г ткани) Malondialdehyde (nmol/g tissue)	86,1±12,3	35,3±6,7	<0,01
Активность каталазы (мкмоль/мин х мг белка) Catalase activity (mkmol/min х mg proteine)	56,2±5,4	26,1±6,4	<0,01

Таблица 4. Профибротические цитокинов в крови и гомогенате стенки мочевого пузыря Table 4. Profibrotic cytokines in blood and bladder wall homogenate

Изучаемый показатель The indicator being studied	Группа 1, (n=10) Group 1,(n=10) M±SD	Группа 2, (n=10) Group 2,(n=10) M±SD	p
Периферическая кровь (пг/мл) Peripheral blood (pg/ml)
Трансформирующий ростовой фактор, бета-1 (TGF beta 1) Transforming growth factor beta 1 (TGF beta 1)	49,3±7,1	24,5 ±6,6	0,02
Фактор роста соединительной ткани (CTGF) Connective tissue growth factor (CTGF)	60,4±9,3	21,4±4,2	<0,01
Гомогенат стенки мочевого пузыря (пг/мл) Bladder wall homogenate (pg/ml)
Трансформирующий ростовой фактор, бета-1 (TGF beta 1) Transforming growth factor beta 1 (TGF beta 1)	56,3±10,2	25,7±7,2	0,03
Фактор роста соединительной ткани (CTGF) Connective tissue growth factor (CTGF)	86,1±12,3	35,3±6,7	<0,01

ОБСУЖДЕНИЕ

Процесс старения является одним из самых сложных биологических процессов, затрагивающим все системы человеческого организма. В 2000 году итальянскими исследователями была представлена теория «inflammaging» (теория воспалительного старения) [3], согласно которой хроническое низкоуровневое воспаление является неотъемлемым «спутником» старения. Это состояние характеризуется значительным увеличением содержания в крови различных воспалительных медиаторов, включая цитокины, активные формы кислорода, реакционноспособные нитрозирующие соединения, факторы роста и др. Данная провоспалительная «смесь» через паракринные сигнальные пути приводит к негативному воздействию на ремоделирование тканей и, в конечном счете, результируется в фибропластическую трансформацию тканей [7]. В настоящее время все больше данных свидетельствует о том,что хроническое воспаление играет ключевую роль в возрастных дисфункциях и заболеваниях [8]. Однако, несмотря на множество проведенных исследований в данной области, влияние «inflammaging» на старение мочевого пузыря остается малоизученным.

Целью данного исследования стало экспериментальное изучение низкоуровневого воспаления и индуцированной им эндотелиальной дисфункции, окислительного стресса и профибротической активности как на системном, так и на органном (мочевой пузырь) уровнях в эксперименте у молодых и старых крыс. В результате работы было продемонстрировано, что у животных с возрастом уровни как сывороточных, так и тканевых маркеров воспаления (ФНО-альфа, Интерлейкин-6, антагонист рецептора интерлейкина-1), эндотелиальной дисфункции (эндотелин-1, интерлейкин–1 бета, специфическая молекула эндотелиальных клеток-1), перикисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид) и профибротиче-ских цитокинов (трансформирующий ростовой фактор бета-1, фактор роста соединительной ткани) повышаются,а уровни антиоксидантной активности (каталаза) статистически значимо снижаются. Эти данные согласуются с результатами исследований, в которых сообщалось, что окислительное повреждение и провоспалительный статус тесно связаны с процессом старения. Так, было показано, что образование активных форм кислорода является решающим элементом в формировании провоспалительного потенциала тка- ней. [9-11]. P. Davalli и соавт. продемонстрировали, что скорость старения напрямую связана с образованием высоких уровней активных форм кислорода и реакционноспособных нитрозирующих соединений [12]. K. Richter и соавт. выявили аналогичную закономерность и показали, что темпы старения имели прямую корреляцию с уровнями активных форм кислорода (АФК) [13]. Исследование, проведенное R. Lutolf и соавт., продемонстрировало, что провоспалительные цитокины, в частности IL-1β приводят к денервации мочевого пузыря, вызывая его гиперактивность. В исследовании P. He и соавт. сообщалось, что IL-1β повреждает афферентные и эфферентные нейроны, которые опосредуют сокращение детрузора, и оказывает прямое апоптотическое действие на нейроны [14]. В работе L.L. Ren и соавт. указывают на ключевую роль суперсемейства трансформирующих факторов роста бета (TGF-β) в развитии фиброза, ассоциированного со старением (aging-related fibrosis) [15]. На аналогичные результаты ссылаются L. Ferrucci и соавт., указывая, что хроническое низкоуровневое воспаление приводит к формированию профибротического фено-типа,в котором суперсемейство трансформирующих факторов роста бета (TGF-β) играет решающую роль в фибропластической трансформации тканей, ассоциированной со старением [16]. В заключение отметим, что приведенные выше литературные данные согласуются с результатами нашего экспериментального исследования. Таким образом, можно сделать вывод о том,что повышение провоспалительных и профибро-тических цитокинов, нарушение ПОЛ вероятно являются одними из значимых факторов процесса сенесценции мочевого пузыря, тем самым подтверждая актуальность теории воспалительного старения (inflame-aging) и открывая широкий круг перспектив геропротективной стратегии в урологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хроническое низкоуровневое воспаление, окислительный стресс, эндотелиальная дисфункция и фибропластическая трансформация являются элементами единого патогенетического континуума фиброз-опо-средованного воспалительного старения (fibrosis-mediated inflam e-aging), играющими ключевую роль в возраст-ассоциированной трансформации мочевого пузыря.

ЛНТЕРАТУРА/REEERENEES

проблемы старения мочевого пузыря