In vitro исследование динамики элюции антибактериальных препаратов, импрегнированных в матрицы на основе полимерного гидрогеля

Ортопедическая инфекция, к которой относятся хронический остеомиелит и перипротезная инфекция суставов (ППИ), является разрушительным осложнением.

Лечение ППИ или хронического остеомиелита длинных костей различается в зависимости от их этиологии, но общим является мультимодальность, подразумевающая тщательную хирургическую санацию, адекватное дренирование раны, местную и системную антибактериальную терапию [1, 2]. В качестве несущей депо-матрицы для местной доставки антибиотиков наиболее

широко в клинической практике используется костный цемент на основе полиметилметакрилата (ПММА) [3]. Однако ПММА, ввиду неполного высвобождения антибиотиков из объема матрицы [3, 4] (до 10 % от общего количества импрегнированного препарата) [5-7], связанного с его гидрофобной природой [1, 8, 9], не может считаться оптимальной системой доставки противо-микробного агента. Так, различные исследования показали, что концентрации антибиотиков, высвобождаемых из костного цемента, превышают минимальные подавляющие концентрации (МПК) для большинства штаммов микроорганизмов только в первые несколько часов или дней после имплантации [2]. Таким образом, неконтролируемое высвобождение препарата из ПММА до настоящего времени остается одной из основных проблем в травматологии и ортопедии, которая не имеет единогласного решения [10].

Идеальная депо-система должна обладать требуемыми фармакокинетическими свойствами, способными обеспечить в течение длительного периода времени элюцию антибиотиков, обеспечивающих их высокие концентрации, многократно превышающие МПК, чтобы стойко купировать инфекцию и предотвратить появление новых полирезистент-ных штаммов бактерий [4]. С этой целью проводятся многочисленные in vitro и in vivo исследования по поиску веществ в качестве добавки к костным цементам и по созданию новых локальных транспортных систем на основе биодеградируемых материалов [10].

Цель – изучить и сравнить скорость и длительность элюции антибактериальных препаратов из образцов на основе полимерного гидрогеля и костного цемента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В рамках исследовательской работы отделение последствий травм опорно-двигательной системы и костно-суставной инфекции ФГБУ НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова совместно с кафедрой биоматериалов РХТУ им. Д.И. Менделеева изготовило оптимальные локальные транспортные системы. Образцы производили из заранее приготовленного и очищенного материала на основе ненасыщенных производных поливинилового спирта (ПВС) в виде водных растворов с концентрацией 8 г/100 мл. Модификация поливинилового спирта проводилась в соответствии с ранее разработанными методиками [11, 12].

Для получения образцов использовались растворы модифицированного ПВС, пероксидисульфат аммония (ПСА) (Aldrich, США) и соль Мора (СМ, сульфат ам-мония-железа (II)) (Химмед, Россия). К 5 мл раствора ПВС добавляли навеску антибактериального препарата в различных концентрациях, тщательно перемешивали до полного растворения агента. После чего полученный раствор переливали в трехкомпонентный шприц Plastipack BD объемом 20 мл с предварительно срезанным конус-наконечником. Последовательно добавляли 0,2 мл 8 % раствора соли Мора и 0,2 мл 10 % раствора ПСА, каждый раз тщательно перемешивая полученные растворы. По завершении процесса гелеобразования сформировывали цилиндры порядка 2 см и диаметром 19 мм.

Для получения образцов из ПММА использовали промышленно выпускаемый костный цемент (Synicem 1, Франция). К 5 г навески порошкообразного полимера добавляли различные концентрации антибиотиков, тщательно смешивали с целью лучшего распределения им-прегнируемого препарата. Далее отверждение проводили согласно инструкции производителя (к навеске полиметилметакрилата добавляли жидкий мономер (2,5 мл)), перемешивали вручную в течение 30-50 с. После достижения пластичного состояния костного цемента с помощью шпателя его загружали в трехкомпонентный шприц Plastipack BD объемом 20 мл с предварительно срезанным конус-наконечником. Далее сформировывали образцы цилиндрической формы, равные объему образцов на основе полимерного гидрогеля.

Для определения модуля сдвига гидрогелей применяли метод пенетрации сферического индентора. Измерение проводили следующим образом: шарик из нержавеющей стали радиусом 1,9 или 3,4 мм вдавливался в плоское верхнее основание образца, и после релаксации, занимающей, как правило, 10-15 с измерялась глубина вдавливания h (уравнение 1). Как правило, глубина вдавливания возрастала на протяжении нескольких первых секунд наблюдения, после чего становилась постоянной, что свидетельствовало о достижении равновесного значения деформации и измерении именно равновесного модуля упругости. При ступенчатом увеличении силы воздействия шарика на гель f, диапазон которой находился в интервале 0,0001-0,01 Н, определяли зависимость h(f) (10-15 точек). Область деформаций h, в которой проводили измерения, не превышала 0,2R.

Обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованием решения контактной задачи теории упругости, согласно которой в рассматриваемом случае (гель значительно мягче, чем стальной шарик) соотношение между глубиной вдавливания шарика h и силой f должно иметь вид:

h = h₀ + bf^2/3 , (1) где коэффициент b зависит от модуля сдвига G и радиуса шарика R, как b = [3/(16GR^1/2)]^2/3.

Из значения наклона по формуле G = 3/(16b^3/2R^1/2) рассчитывали модуль сдвига. Как правило, разброс в значениях модуля для образцов из полимерного гидрогеля составлял в среднем ± 6 %.

Для количественного определения биологически активных веществ в растворах использовался спектрофотометрический метод с получением зависимостей оптической плотности растворов от концентрации антибиотиков.

Изучение динамики выделения введенных антибактериальных препаратов из объема сравниваемых образцов проводили в статических условиях. Для этого цилиндрические образцы объемом 5 см3, содержащие антибиотик, помещали в 10-кратный избыток фосфатного буферного раствора и инкубировали при 37 °С. Концентрации антибиотиков в растворе определяли при помощи спектрофотометрии. Измеряли интенсивность поглощения при характерной длине волны по предварительно построенным для каждого препарата зависимостям интенсивности поглощения от концентрации. Замену физиологического раствора осуществляли через 1 час и на 1, 3, 7, 14, 21 и 28 сутки. Подобный дизайн эксперимента был выбран нами на основании изучения публикаций по данной тематике для возможности сопоставления полученных нами данных с результатами других авторов [1, 13]. Параллельно изучалось не менее 5 образцов каждого состава. Полученные данные ус- реднялись. Для статистической обработки полученных экспериментальных данных – медианы (Me) и доверительного интервала (95 % ДИ) – использовали статистические функции программы Microsoft Excel.

Импрегнацию противомикробных агентов для насыщения сравниваемых образцов несущих матриц производили рифампицином, цефазолином и ванкомицином. Выбор данных антибиотиков основан на их широкой доступности, распространенности применения в клинической практике и различных физико-химических свойствах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поскольку формирование образцов, как в случае полимерных гидрогелей, так и в случае костного цемента, происходило в результате свободно-радикальной полимеризации, вводимые на стадии формирования образца антибиотики могли влиять на данный процесс как вследствие передачи и обрыва кинетической и материальной цепи, так и вследствие взаимодействия с компонентами используемых окислительно-восстановительных инициирующих систем. В силу этого, на первом этапе работы проводилась оценка максимально возможной концентрации антибиотика в формируемых образцах.

Полученные данные выборочно приведены в таблице 1. Как можно видеть, в зависимости от вида максимальная концентрация антибиотика, при которой удавалось получить гидрогелевые полимерные системы с достаточными механическими свойствами (модуль упругости, близкий к модулю мягких тканей), изменялась от 60 до 80 мг/см3.

Аналогичные предварительные эксперименты проводились и для костного цемента. Здесь критерием являлся факт получения монолитного блока отвержденного цемента.

По истечении первых суток исследования концентрация антибиотиков, высвобожденных из большинства образцов на основе ПММА, независимо от типа лекарственного препарата и его загрузки в объем материала, не превышала 400 мг/л. В дальнейшем происходило заметное снижение количества выделяемого препарата. Так, в течение 2-х суток наблюдения скорость изменения концентрации препарата в случае ванкомицина была примерно в 6 раз, рифампицина – в 8,5 раз и цефазолина – в 7 раз ниже по сравнению с первыми сутками (табл. 2 и рис. 1, а; рис. 2, а; рис. 3 а). В дальнейшем снижение скорости выделения препарата происходило более плавно, однако спу- стя 14 суток регистрируемые концентрации препаратов в элюате, как правило, были ниже МПК. В случае образцов на божденных препаратов на 1 сутки достигали 3000 мг/л и более (табл. 3). Снижение скорости выделения было не столь выраженным по сравнению с ПММА. Так, на 3-и сутки скорость элюции в среднем снизилась в случае ванкомицина в 2 раза, рифампицина и цефазолина – в 3,3 раза (рис. 1, б; рис. 2, б; рис. 3, б). В силу этого в течение всего периода наблюдения регистрировались концентрации препарата выше МПК.

Данные 5 параллельных исследований для образцов костного цемента представлены в виде средних значений (Me) и 95 % ДИ в таблице 2, для полимерного гидрогеля – в таблице 3.

Таблица 1

Влияние концентрации вводимого в композицию антибиотика на процесс формирования образцов

Антибиотик	Концентрация, мг/см3	Гидрогель	Костный цемент
		Модуль упругости, кПа	Сшивка
Цефазолин	20	27,6 ± 1,5	да
	40	23,6 ± 2,6	да
	60	18,4 ± 1,8	да
	80	10,2 ± 2,7	да
	100	–	нет
Ванкомицин	20	28,3 ± 1,9	да
	40	25,6 ± 1,7	да
	60	22,4 ± 2,3	да
	80	15,3 ± 2,8	да
	100	7,3 ± 1,9	да
Рифампицин	20	23,2 ± 1,6	да
	40	20,2 ± 2,3	да
	60	18,6 ± 2,1	да
	80	9,7 ± 1,4	нет
	100	–	нет

Таблица 2

Концентрации антибиотиков, элюированных из образцов на основе ПММА в контрольные дни исследования. Данные представлены в виде Me (95 % ДИ)

Время, дни	Концентрация препарата, мг/л, Me (95 % ДИ)
	Ванкомицин			Цефазолин			Рифампицин
	40 мг/см3	60 мг/см3	80 мг/см3	20 мг/см3	40 мг/см3	60 мг/см3	20 мг/см3	40 мг/см3	60 мг/см3
1	264 (255; 273)	373 (361; 385)	433 (414; 452)	111 (106; 116)	212 (202; 222)	294 (276; 312)	160 (158; 162)	282 (265; 299)	372 (342; 402)
3	79,6 (75,6; 83,6)	102,6 (95,2; 110)	129,4 (122,5; 136,3)	29 (28,5; 29,5)	52,4 (51,8; 53)	71 (66,8; 75,2)	29 (28,5; 29,5)	43,2 (40,5; 45,9)	67,4 (31,4; 103,4)
7	64,4 (63,3; 65,5)	84,6 (79,9; 89,3)	107,6 (99,8; 115,4)	26 (25; 27)	46,2 (44; 48,4)	61 (58,9; 63,1)	26 (24,9; 27,1)	38,6 (36,9; 40,3)	55,4 (53,1; 57,7)
14	44,2 (42; 46,4)	57 (53,8; 60,2)	74,2 (68; 80,4)	18,3 (18; 18,6)	30,2 (28,6; 31,8)	48,8 (46,8; 50,8)	23,5 (22,3; 24,7)	35,9 (34,3; 37,5)	50,2 (49; 51,4)
21	27,2 (25; 29,4)	34,6 (32,5; 36,7)	45 (42,7; 47,3)	10,8 (9,9; 11,7)	18,6 (17,7; 19,5)	27,1 (26; 28,2)	18,4 (17,5; 19,3)	26,6 (26; 27,2)	40,4 (38,8; 42)
28	18,8 (16,6; 21)	22,4 (20,7; 24,1)	31,6 (30,5; 32,7)	7,5 (7,2; 7,8)	13,4 (12,9; 13,9)	17,6 (17; 18,2)	12,8 (12,3; 13,3)	19,4 (18,8; 20)	26,7 (25,2; 28,2)

Таблица 3

Концентрации антибиотиков, элюированных из образцов на основе полимерных гидрогелей в контрольные дни исследования. Данные представлены в виде Me (95 % ДИ)

Время, дни	Концентрация препарата, мг/л, Me (95 % ДИ)
	Ванкомицин			Цефазолин			Рифампицин
	40 мг/см3	60 мг/см3	80 мг/см3	20 мг/см3	40 мг/см3	60 мг/см3	20 мг/см3	40 мг/см3	60 мг/см3
1	1613	2491	3235	933 (868; 998)	1742	2224	936 (852; 1020)	1642	2354
	(1556;1670)	(2391;2591)	(3010;3460)		(1618;1866)	(1954;2494)		(1588;1696)	(2227;2481)
3	1024 (962; 1086)	1501 (1435;1567)	2001 (1942;2060)	407 (388; 426)	833 (755; 911)	1060 (974; 1146)	408 (386; 430)	826 (783; 869)	1090 (1047;1133)
7	124 (115; 133)	176 (168; 185)	224 (214; 234)	184 (177; 191)	402 (388; 416)	634 (593; 675)	180 (164; 196)	395 (377; 413)	622 (586; 658)
14	61 (57; 65)	101 (97; 105)	132 (129; 135)	86 (80; 92)	142 (135; 149)	218 (204; 232)	88 (86; 90)	135 (130; 140)	224 (219; 229)
21	42 (40; 44)	63 (57; 69)	78 (75; 81)	68 (64; 72)	94 (91; 97)	127 (122; 132)	66 (64; 68)	89 (86; 92)	129 (126; 132)
28	32 (30; 34)	45 (42; 48)	54 (51; 57)	44 (41; 47)	66 (62; 70)	77 (75; 79)	43 (41; 45)	64 (62; 66)	78 (72; 84)

Рис. 1. Ванкомицин. Образцы на основе ПММА (А) и полимерного гидрогеля (Б). Количество выделенного препарата ( • , ▲ , ■ ) и динамика его выделения ( О , О , □ ) при различной исходной концентрации препарата в образцах. Исходная концентрация препарата: ( • , О ) - 40, ( ▲ , О ) - 60, ( ■ , □ ) - 80 мг/см³

Рис. 2. Цефазолин. Образцы на основе ПММА (а) и полимерного гидрогеля (б). Количество выделенного препарата ( • , ▲ , ■ ) и динамика его выделения ( О , О , □ ) при различной исходной концентрации препарата в образцах. Исходная концентрация препарата: ( • , О ) - 20, ( ▲ , О ) - 40, ( ■ , □ ) - 60 мг/см³

Общее количество препарата, выделившегося из объема образцов в период наблюдения, в случае ПММА составило для ванкомицина 8,2-10 %, рифампицина – 8,1-10,8 %, цефазолина – 6,9-8,1 % (рис. 1, а; рис. 2, а; рис. 3, а) от массы введенного на стадии формирования. Причем, до 80 % от этой небольшой высвобожденной доли пришлось на 4-5 сутки. Из гидрогелевых образцов выделилось до 73 % препарата в случае ванкомицина и до порядка

86 % – в случае рифампицина и цефазолина. Выделение большей части (до 90 %) произошло в первую неделю исследования.

На примере ванкомицина (рис. 4) продемонстрировано соотношение скоростей релиза препарата из полимерного гидрогеля и костного цемента при его различных концентрациях в зависимости от продолжительности инкубирования. Аналогичный вид это соотношение имело и для других препаратов.

Рис. 3. Рифампицин. Образцы на основе ПММА (а) и полимерного гидрогеля (б). Количество выделенного препарата ( • , ▲ , ■ ) и динамика его выделения ( О , О , □ ) при различной исходной концентрации препарата в образцах. Исходная концентрация препарата: ( • , О ) - 20, ( ▲ , О ) - 40, ( ■ , □ ) - 60 мг/см³

Рис. 4. Ванкомицин. Соотношение скоростей выделения включенного препарата из образцов на основе полимерного гидрогеля и ПММА при различной исходной концентрации препарата в образцах. Исходная концентрация препарата: ( О ) - 40, ( ▲ ) - 60, ( □ ) - 80 мг/см³

ОБСУЖДЕНИЕ

В целом можно констатировать, что объемы препарата, которые могут быть введены в оба типа материалов, сопоставимы, хотя в случае костного цемента для изученных модельных лекарственных препаратов эти значения несколько выше. При этом данные, полученные для ПММА, соотносятся с данными ряда работ, посвященных элюционным характеристикам костных цементов, импрегнированных антибиотиком [4, 13, 14]. В них было продемонстрировано, что максимально допустимая концентрация импрегниро-ванного противомикробного агента для большинства используемых веществ, как правило, не превышает 5 % от массы образца костного цемента.

Как можно видеть (см. табл. 2 и рис. 1-3), для всех использованных антибиотиков при их включении в образцы на основе ПММА, несмотря на их различные физико-химические свойства (молекулярная масса, растворимость в воде и др.), наблюдалась сходная картина. Имела место достаточно низкая доля релиза включенного препарата, не превышающая 10 %, то есть, имело место выделение препарата лишь из поверхностных слоев образца (порядка 2-3 мм) (см. рис. 1, а; рис. 2, а; рис. 3, а). Причем, элюция основной части (до 80 %) от этой небольшой доли выделенного препарата зафиксирована в течение первых нескольких дней. По про- шествии 3-4 суток исследования скорость выделения антибиотика из костного цемента снижается на порядок и более, в силу чего для большинства использованных концентраций к 14 суткам наблюдения содержание элюированного препарата в растворе становится ниже МПК (см. табл. 2, рис. 1, а; рис. 2, а; рис. 3, а). Полученные нами результаты сопоставимы с данными других научных работ, изучавших высвобождение других видов антибиотиков из ПММА [5, 8, 9, 14-19]. К примеру, Moojen et al. наблюдали релиз субтерапевтических концентраций гентамицина и тобрамицина из спейсеров на основе ПММА уже через 1 неделю после имплантации [17]. Потенциал элюции различных групп антибактериальных препаратов из костного цемента, независимо от их физико-химических свойств, согласно изученным литературным источникам, колебался от 0,05 до 9,7 % [1, 4, 7, 8, 15, 20-22], а, по некоторым данным, достигал 17 % [5, 23].

Все протестированные антибиотики продемонстрировали двухфазное поведение элюции из ПММА, что является общей чертой для всех костных цементов [6, 7, 9, 10, 24], заключающейся во взрывном высвобождении [1, 19, 22, 25] (< 96 ч) [2] (бёрст-релиз) за счет элюции преимущественно поверхностно-связанных частиц препарата [15] (50-100 мкм от поверхно- сти) [26, 27] с последующим кратковременным в 2-5 раз более медленным высвобождением противомикробного агента, которое обусловлено их затрудненной диффузией из объема матрицы [16, 21]. Известно, что релиз концентраций ниже МПК чреват появлением резистентных штаммов микроорганизмов [17, 21] и их способностью, ввиду гидрофобности цемента [25], обсеменять поверхность ПММА [6, 18, 26, 28] и формировать микробные биопленки [2, 24], что приводит к неоднократным рецидивам ортопедической инфекции [5, 10, 29] и, следовательно, неудовлетворительным исходам лечения. Увеличение же навески препарата, импрегнируемого в состав костного цемента, незначительно повышает релиз антибактериального препарата [24], поскольку способствует появлению в основном приповерхностных участков, что и объясняет биодоступность незначительного количества лекарственного агента при его многократной загрузке в объем ПММА [15].

Скорость релиза из ПММА как ванкомицина, характеризующегося сравнительно большой молекулярной массой [6, 10, 15], так и цефазолина [30] и рифампицина, имеющих низкую молекулярную массу, в нашем исследовании практически не отличалась. Аналогичные результаты описаны другими авторами при сравнении скоростей элюции ванкомицина из костного цемента с другими низкомолекулярными антибиотиками, в частности тобрамицином и гентамицином [15, 25, 31].

У гидрофильных полимерных гидрогелей наблюдалась несколько иная картина. Как видно из демонстрируемых зависимостей (см. табл. 3, рис. 1, б; рис. 2, б; рис. 3, б), для всех образцов этого типа имел место релиз на порядок большего количества импрегнирован-ного препарата, достигший 70 % и более. В силу этого, несмотря на то, что, как и в случае костного цемента, наблюдался бёрст-релиз, и большая часть препарата высвободилась в первые 5-7 суток наблюдений, концентрация элюированного антибиотика из гидрогелей была кратно выше и превышала МПК в течение всего периода наблюдения (табл. 3). Высвобождение такого объема противомикробного агента из гидрофильных гидрогелей обусловлено диффузией частиц из всего объема матрицы, что является важным преимуществом по сравнению с костным цементом, который обладает минимальным потенциалом релиза препарата из внутреннего объема материала [15, 25].

Также заметно отличалась и скорость элюции антибиотиков. Например, для ванкомицина в случае гидрогелей скорость выделения в первые сутки наблюдения была примерно в 7, вторые – в 17, третьи – в 12, и последующие дни в 2 раза выше по сравнению с образцами на основе костного цемента (рис. 4). Аналогичная картина наблюдалась и для других рассмотренных антибиотиков.

Как показано на рис. 1 и 2, динамика высвобождения цефазолина, молекула которого намного меньше, явным образом отличается от динамики выделения ванкомицина. При том, что модули упругости, и, следовательно, частота сшивки полимерной сетки для всех образцов отличаются незначительно (табл. 1). Из чего можно заключить, что растворимость и молекулярная масса препарата, импрегнированного в полимерный гидрогель, и динамика его десорбции взаимосвязаны в отличие от костного цемента. Так, J. Slane et al. сообщили о высвобождении всего 1,08 мг тобрамицина, молекулярная масса которого кратно меньше цефазо-лина, из объема ПММА [25].

Исходя из полученных нами результатов, которые представлены в виде графиков для каждой группы антибиотиков в составе полимерного гидрогеля, можно сделать вывод, что взаимодействие между гидрогелевой матрицей и молекулами иммобилизуемых в ней веществ позволит посредством ее модификации создать системы с требуемым профилем выделения включаемого препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на данном этапе нами показана принципиальная возможность создания систем на основе ненасыщенных производных ПВС с контролируемым релизом антибиотиков, которые потенциально превосходят по своим характеристикам используемые в настоящее время депо-системы на основе костного цемента.