Инактивация микроорганизмов в холодной аргоновой плазме атмосферного давления

В настоящее время все большую актуальность приобретают работы, направленные на исследование свойств газоразрядных процессов, определяющих возможности их применения для стерилизационной и обеззараживающей обработки в области защиты промышленных материалов, оборудования, электроники от биоповреждений и микробиологически индуцированной коррозии [1-3]. Обработка живых тканей в плазме оказывает желаемый терапевтический эффект при стерилизации и заживлении ран, остановке кровотечения, а также при лечении ряда кожных заболеваний [4-6]. Это направление приобретает особое значение в последние годы, что связано с возрастающей потребностью человечества в новых, не требующих высоких температур технологиях стерилизации и обеззараживания с высокой производительностью, простотой эксплуатации, эффективностью и надежностью.

Особое место среди плазменных методов занимают исследования разрядов, генерирующих низкотемпературную (холодную) неравновесную плазму при атмосферном давлении [711]. В качестве источников низкотемпературной неравновесной плазмы атмосферного давления рассматриваются различные типы газовых разрядов, среди которых можно отметить скользящий, коронный, барьерный и импульсные разряды атмосферного давления. Несмотря на широкий круг работ [12, 13], посвященных исследованиям различных характеристик разрядов, и доказанную высокую эффективность использования разрядов в биомедицинских целях в лабораторном масштабе, обработка холодной плазмой при атмосферном давлении с целью уничтожения микроорганизмов не получила широкого применения. Это связано, во-первых, с тем, что источники холодной плазмы в настоящее время представляют собой технически сложное оборудование с низкой экономической эффективностью. Во-вторых, для обработки биологических объектов, живых тканей животных и человека используются разряды атмосферного давления при высоком напряжении (10-40 кВ), что требует обеспечения высокого уровня безопасности. Поэтому выбор параметров разряда, при которых осуществляется безопасное и неразрушающее воздействие, ‒ одна из основных физических задач плазменной медицины.

Целью данной работы является изучение воздействия низкотемпературной (холодной) аргоновой плазмы, генерируемой слаботочными высоковольтными разрядами на инактивацию микроорганизмов.

Экспериментальная техника и методика

Данный способ базируется на использовании плазменных струй слаботочного искрового разряда атмосферного давления, формируемых в потоке аргона [8, 9] и предназначен для генерации низкотемпературной (холодной) аргоновой плазмы на основе слаботочных высоковольтных разрядов.

В исследовании использовали штаммы природной ассоциации микроорганизмов и вегетативной формы Escherichia coli М 17. Для оценки чувствительности микроорганизмов, к холодной аргоновой плазме, генерируемой плазменными струями слаботочного искрового разряда, использовали методику, основанную на измерении диаметров зон поражения засеянного газона. Для этого засевали газон тест-микроорганизмами: 100 мкл рабочей суспензии вносили на чашку Петри с агаризованной средой ГРМ и тщательно растирали шпателем. Чашки с засеянным газоном помещали в газоразрядную камеру под плазменные струи. Обработанные плазмой чашки инкубировали в термостате в течение суток при температуре 37 ° С, после чего измеряли диаметр образовавшихся зон поражения.

Результаты эксперимента и их обсуждение

Исследована эффективность биоцидного действия холодной аргоновой плазмы, генерируемой плазменными струями слаботочного искрового разряда, при воздействии на бактерии природной ассоциации микроорганизмов и вегетативной формы E. coli. На рисунке 1 представлен генератор холодной аргоновой плазмы на основе плазменных струй слаботочного ис- крового разряда.

Рис. 1. Генератор холодной аргоновой плазмы на основе плазменных струй: а – инактивация микроорганизмов в чашке Петри; б – вид разряда с торца

Время обработки чашек плазменными струями слаботочного искрового разряда варьировалось от 5 до 60 с. Расстояние от источника плазмы до поверхности, на которой росли микроорганизмы, составляло от 0,5 до 3 см. Воздействие плазменных струй слаботочной искры на микроорганизмы регистрируется в виде круглых прозрачных областей, которые являются зонами инактивации роста микроорганизмов (рис. 2).

Рис. 2. Зоны инактивации бактериального роста природной ассоциации микроорганизмов в результате воздействия плазменных струй слаботочного разряда: a – t=10 с; f – t = 60 с

Полученные данные показывают, что обработка чашек плазменными струями слаботочной искры в течение 10 с приводит к гибели практически всех микроорганизмов в радиусе 0,9 см. После 60-секундной обработки диаметр зоны инактивации бактерий увеличивается в 1,6 раза. Определение инактивационной способности аргоновой плазмы, проведенное методом счета колоний, показывает, что после минутной обработки остаются лишь единичные выросшие макроколонии микроорганизмов (рис. 4 (1f)). Диаметр зоны инактивации значительно увеличивается при прямом контакте плазменных струй с поверхностью чашек (кривые 1, 2, рис. 3), чем при удаленном воздействии (кривая 3, рис. 3).

Рис. 3. Зависимость диаметра зоны инактивации от времени воздействия

Бактерицидные свойства плазменных струй слаботочного искрового разряда исследовались по воздействию на вегетативную форму штаммов Escherichia coli . Культура Escherichia coli была выращена на агаризованной богатой среде в виде газона. Опытные купоны с Escherichia coli подвергали воздействию плазменных струй, варьируя продолжительность экспозиции от 5 до 60 с.

Полная гибель клеток E. coli зарегистрирована через 5 с обработки на расстоянии 0,5 см от сопла, при увеличении расстояния от сопла генератора до 3 см число выживших макроколоний микроорганизмов значительно возрастает. Увеличение времени плазменной обработки до 40 с на расстоянии 3 см от сопла приводит к существенному снижению числа выживших микроорганизмов (рис. 4 (2)). Отметим, что зона инактивации не огранивается диаметром сопла генератора, в пределах которого формируются плазменные струи слаботочной искры.

1 – h = 0,5 см, t=30 с, 2 – h = 3 см, t = 40 с

Рис. 4. Зоны инактивации бактериального роста E. coli в зависимости от расстояния от сопла h генератора плазменных струй

Как видно из рисунка 5, увеличение времени обработки чашек плазменными струями слаботочной искры позволяет проводить эффективную инактивацию на значительно большей площади. Данные результаты согласуются с результатами, представленными в работе [17], где с увеличением времени обработки холодными плазменными струями атмосферного давления (99,5% гелий и 0,5% кислород) бактерий Pseudomonas aeruginosa на твердом агаре диаметр зоны инактивации увеличивается. Обработка низкотемпературной гелиевой плазмой также приводит к ингибирующему эффекту на агаризированной культуре Staphylococcus aureus [18].

Расстояние от сопла генератора h = 0,5 см.

Рис. 5. Зависимость площади зоны инактивации от времени воздействия

Заключение

Показана высокая эффективность бактерицидного действия источников холодной аргоновой плазмы на основе слаботочных высоковольтных разрядов. Изучение выживаемости бактерий в диффузной плазме импульсно-периодического режима отрицательной короны показало, что полная инактивация микроорганизмов наблюдается после обработки пластин после 2 мин в каждом режиме. Установлено, что у величение времени обработки плазменными струями слаботочной искры позволяет проводить эффективную инактивацию микроорганизмов на значительно большей площади, чем площадь сопла генератора плазмы.