Индекс фрагментации ДНК -маркер фертильности спермопродукции норок

Успехи современной зооветеринарной практики в вопросах лечения бесплодия сельскохозяйственных самцов-прозводителей в комплексе с применением вспомогательных репродуктивных технологий определяют острую необходимость совершенствования методов ветеринарной лабораторной диагностики по установлению этиопатогенетических механизмов развития инфертильности.

Перевод животноводства на промышленную основу спровоцировал изменение условий содержания пушных зверей в условиях доместикации, лишая их привычной естественной среды обитания.

Известно, что современные индустриальные способы содержания животных (изменение функциональных нагрузок организма, адаптационные реакции на внешние раздражители, вызывающие стресс) негативно влияют на гомеостаз и продуктивность в целом.

В таких сложившихся условиях чаще всего страдает молодняк зверей из-за несовершенства физиологического состояния организма и снижения естественной резистентности, ведущей к снижению продуктивности в пушно-меховой отрасли.

Для увеличения пушно-меховой продуктивности требуется улучшение кормовой базы, за счет оптимизации структуры рациона, использования раз- личных доступных нетрадиционных кормовых добавок, улучшающих качество корма и оказывающих положительное влияние на физиологическое состояние организма.

В настоящее время широко интегрируется в отечественную кормоинду-стрию перспективное направление по применению гидролизатов животных белков в составе базового питания. Так, белковые добавки способны оказывать активное влияние на гомеостаз организма животных, на его физиологические функции, а также репродуктивные показатели [11]. Репродуктивная функция одна из важных функций организма, которая обладает мощным инструментом в обеспечении зачатия, рождения и выхаживания зрелого жизнеспособного потомства и является наиболее чувствительным маркером, точно отражающим любое отклонение от показателей нормы в организме и напрямую зависящим от полноценного кормления, которое занимает приоритетное значение в норководстве.

В соответствии с вышесказанным, цель нашего исследования состояла в определении роли белкового питания на репродуктивные функции самцов норок, путем введения белкового гидролизата в качестве кормовой добавки в их основной рацион. Кормление обеспечивает опти- мальную потребность организма в энергии, протеине, незаменимых аминокислотах, минеральных веществах, витаминах, необходимых для нормального протекания морфофизиологических, гормональных, биохимических, биофизических процессов сперматогенеза и овогенеза в репродуктивных органах любого вида животных. Морфофункциональное строение, целостность, активность половых клеток напрямую зависит от правильного баланса белков, жиров и углеводов в базовом питании, а также от аминокислотного состава рациона, поскольку дефицит какой либо одной аминокислоты (лимитирующей) в рационе может привести к частичному неусвоению всех остальных, возникновению дисбаланса гомеостаза организма, приводящего к различным цитоатипиям гамет в эякуляте, где атипичные структуры половых клеток представлены различными морфологическими аномалиями сперматозоидов и функциональными нарушениями отдельных структурных единиц.

Трофическое обеспечение гамет зависит от каскада биохимических реакций, синтеза и катаболизма нуклеопротеидов метаболического процесса. Нуклеопротеиды поступают в организм вместе с пищей и распадаются на белки, в дальнейшем на аминокислоты в тонком отделе кишечника, а блокировка или локальное нарушение какой–либо из фаз процесса метаболизма ведет к возникновению аномальных форм.

По данным Е.Е. Брагиной (2014), в последние годы к лабораторному критерию качества сперматозоидов относят оценку структурных нарушений хромосом – это не правильная упаковка и наличие разрывов нитей ДНК в головке спермия [2]. Уже известно, что сперматозоиды с фрагментацией ДНК могут повреждать яйцеклетку, в результате чего она теряет функциональность, эмбрион не образуется, протокол оплодотворения оканчивается неудачно. Если уровень фрагментации ДНК невысок, то в некоторых случаях молодая и здоровая яйцеклетка может восстановить структуру нуклеотидной цепочки из имеющихся нуклеотидных остатков в цитотоли клетки. Считается, что окислительный стресс сперматозоидов выражает- ся в повреждении свободными радикалами их мембран, белков и ДНК. В норме радикалы нейтрализуются антиоксидантами, но при метаболических нарушениях, при воспалительных процессах, иммунных расстройствах баланс гомеостаза нарушается, активных форм кислорода становится больше, и они начинают проявлять свое негативное влияние на те или иные органы.

Чаще всего этот процесс запускается на стадии мейоза в половых железах норок и продолжается до выхода сперматозоидов из их придатка, поэтому при снижении фертильности животного организма необходимо в базовый рацион животных вводить различного рода добавки, на основе аминокислот, для регулирования белкового, липидного и углеводного метаболизма.

Материал и методы исследований. Объектом исследования были самцы норки. Для проведения исследования было сформировано три группы: I и II группа -опытные, III контрольная, при этом в каждой группе – по семь голов самцов годовалого возраста. Животным первой и второй групп к основному рациону добавляли по 2 и 4 мл 15 % раствора белкового гидролизата, соответственно, в то время как контрольные аналоги находились на обычном рационе. Введение гидролизата опытным группам в рацион начинали за два месяца до начала гона и в период него. Белковый гидролизат, полученный нами в ЗАО «Биопрогресс» [1, 3], содержал в своем составе весь спектр незаменимых аминокислот, учитываемых в пушном звероводстве. Дозу гидролизата определяли из необходимой потребности животных в аминокислотах и по фактическому содержанию ЛНАК (лимитирующие аминокислоты) в рационе. Сбор спермы проводили из влагалища самок норок, после прерванного коитуса, с помощью пипетки. Активность сперматозоидов определяли с помощью пакет программы «AndroVision®». Для оценки морфологии сперматозоидов использовали набор реагентов SpermBlue и программное обеспечение Argus-CASA. Состояние ДНК в сперматозоидах изучали методом акридин-оранжевого теста (АО- тест) с использованием флуоресцентной микроскопии. Целостность акросом сперматозоидов изучали с помощью ДИФ-Квик окрашивания. Для статистического анализа полученных данных использовали пакет программы анализа данных программы IBM SPSS Statistics 23.0 («IBM Corp.», США).

Результаты исследований. Подвижность сперматозоидов в опытной и контрольной группе существенно отличались. В I и II опытных группах содержание подвижных сперматозоидов составило соответственно 62±1,6 и 61±0,9 в контрольной группе 53±1,9 % (Таблица 1). Между опытными группами по содержанию прогрессивно подвижных сперматозоидов ста- тистическое значимое различие не установлено. Первая опытная группа по данному показателю превосходила контрольной группу на 17 % (p≤0,01) и вторая на 15 % (p≤0,01). Анализ траектории подвижности активных сперматозоидов показывает, что движение сперматозоидов норок отличается по характеру движения. Сперматозоиды двигаются прогрессивно криволинейно.

В эякуляте контрольной группы доля сперматозоидов с непрогрессивным движением составила более 18 %, что в 1,9 больше по сравнению со второй опытной группой. Разница между опытными группами и контрольной группой оказалась статистическая достоверная при p≤0,001.

Таблица 1 – Качество спермы норок в зависимости от состава рациона

Показатель	Группы
	I опытная	II опытная	Контрольная
Содержание сперматозоидов, %: прогрессивно-подвижные	62,0±1,6**	61,0±0,9**	53,0±1,9
непрогрессивно-подвижные	11,4±0,6***	9,6±0,7***	18,3±0,3
Неподвижные	26,6±1,4	29,4±1,6	28,7±0,8
Морфологические аномалии, %	12,7±0,6**	13,5±0,9**	19,3±0,8
Индекс фрагментации ДНК, %	2,0±0,1***	2,1 ±0,1***	30±0,8

Рисунок 1 – Частота встречаемости патологии в отдельных сегментах сперматозоидов

Наивысшая частота аномалии морфологии в эякуляте наблюдалась в контрольной группе. Содержание сперматозоидов с различными морфологическими нарушениями в данной группе в среднем составило 19,3 % и в зависимости от индивидуальных особенностей самца варьиро- вало от 14 до 26 %.

Исследуемые группы отличались по частоте встречаемости аномалии отдельных сегментов сперматозоидов. При этом сохранялась общая закономерность, когда наиболее часто встречались патологии в головке и средней части сперматозоидов

(Рисунок 1).

В исследованиях, проведенных нами, были зафиксированы следующие патологические формы сперматозоидов норок: дефекты головок - присутствие образцов безъядерных, шаровидных и конусовидных форм. При этом в головках аномальных спермиев наблюдали изменение локализации акросомы и даже её отсутствие в контрольной группе. Дефекты шейки и средней части гамет в образцах были представлены сперматозоидами во всех экспериментальных группах, наличие спиралевидно сложенного жгутика в контрольной группе.

В 70 % образцах, полученных от самцов контрольной группы, встречались сперматозоиды с фрагментацией ядерной и митохондриальной ДНК. Индекс фрагментации ДНК в сперматозоидах самцов контрольной группы в среднем составил 30 %, у первой опытной группы в полученных эякулятах индекс фрагментации ДНК в среднем составил 2 %, во второй опытной группе 2,1 %. Разница между контрольной и опытными группами была статистически значимой при p<0,001. Часто встречалась фрагментация ДНК в хроматине сперматозоидов контрольной группы норок (Рисунок 2).

• □ и ДНК ■ яДНК ■ вцДНК |

Рисунок 2 - Степень фрагментации ДНК в сперматозоидах иДНК - интактная ДНК; яДНК -ядерная ДНК; мДНК - митохондриальная ДНК

При исследовании образцов спер-мопродукции самцов-норок по показателю индекса фрагментации ДНК было зафиксировано следующее: образцы спермопро-дукции самцов–производителей контрольной группы имели структурные нарушения как в яДНК (головке сперматозоидов), так и в мДНК (средняя часть). Вероятно, это обстоятельство напрямую коррелирует с отсутствием недостаточного количества в базовом рационе аминокислот, участвующих в синтезе нуклеотидов и протаминов. В спермопродукции самцов-производителей норок опытной группы подобного рода деструктивные изменения не были обнаружены. Основную массу хроматина представляют белки гистоны. Гистоны - нуклеотидные белки, активно участвующие в переписывании информации с гена на информационную РНК, а также в репарации поврежденных локусов цепи ДНК; от плотности расположения гистонов в активно экспрессирующихся участках генома зависит и интенсивность экспрессии генов. Так, в норме хроматин зрелых сперматозоидов плотно упакован, чтобы защитить ДНК от потенциальных повреждающих воздействий во время транзита его по органам репродуктивной системы. Высокая плотность гистонов формирует «закрытую структуру» хроматина, что приводит к инактивации генов; если хроматин конденсирован, то гены находятся в инактивированном состоянии, если хроматин открыт (декондесирован) и активен, то это определяет активацию экс- прессии генов. В свою очередь, динамика состояния хроматина определяется и контролируются такими обратимыми процессами, как метилирование ДНК и модификация гистонов.

Сегодня уже известно, что «выключение» генов осуществляется при помощи метилирования ДНК (прикрепления к цитозиновым основаниям ДНК метильной группы СН 3 ). «Включение» происходит за счет ацетилирования гистонов (белков в составе хроматина, необходимых для сборки и упаковки ДНК); в результате плотного контакта ДНК и гистонов в хроматине половой клетки, происходит блокирование концевых участков «хвостов» ДНК (ограничивает свободу вращения концевых нитей), что препятствует специфическим ферментам доступ к определенным локусам ДНК при сканировании наследственной информации.

От того, как цепочка ДНК упаковывается в ядре половой клетки, зависит и количество того или иного белка, который синтезируется в клетке на нужды ее существования, а выявленные цитопатологии в половых клетках, при получении данных по проведенному эксперименту, яркое тому подтверждение. Это согласуется с данными зарубежной литературы Evenson D.P., Larson K.L., Jost L.K., (2002), Agarwal A., Said T.M. (2003), Erenpreiss J., Spano M., Erenpreisa J. (2006), Kempisty B., Depa-Martynow M., Lianeri M. (2007) [4, 7, 8, 9]. Возникновение цитопатологий в спермо-продукции животных характеризуется такими нарушениями как нарушение физической целостности молекулы ДНК в виде разрыва одной или обеих полинуклеотид-ных цепей (фрагментация); дефектов ядер-ных белков, препятствующих замене гистонов на протамины с последующим уплотнением ДНК; нарушением пространственной третичной структуры хроматина.

При движении спермия по половым путям самки (подвижность гаметы сохраняется в анаэробных условиях) включается альтернативный механизм катабализма – гликолиз, в ходе которого и формируются молекулы АТФ, тем самым поддерживается двигательная активность спермия. Активация подвижности сперматозоидов за- висит от циклического аденозинмонофосфата (АМФ), производного АТФ, который, будучи универсальным регулятором метаболических реакций, активизирует цАМФ – зависимую протеинкиназу. Протеинки-наза фосфорилирует белки, а каталитические субъединицы протеинкиназ способны пересекать ядерные мембраны и фосфорилировать ядерные белки – гистоны, тем самым, регулировать генную активность половых клеток.

Полученные данные в ходе проведения эксперимента по выявлению и обнаружению фрагментированных участков ДНК в спермопродукции норок контрольной группы, не получавших в базовом рационе белковый гидролизат, позволяют нам комментировать данную ситуацию с позиции недополучения ими соответствующего белкового питания, что и отражается в процессах фрагментации цепей ДНК спермиев.

Высокое содержание оксидантов в ее окружении приводит к мутациям в мДНК с частотой в 10-20 раз большей, чем в яДНК. При репликации образуется трехнитчатая мДНК (промежуточное звено), которая очень восприимчива к делециям [13, 14]. Точечные мутации и делеция фрагментов мДНК приводят к патологии митохондриальной дыхательной дисфункции, что является одной из причин патологий спермий [5, 10, 15]. Исследования ультраструктур сперматозоидов показывают, что мутация ДНК, а также другие повреждения митохондрий сперматозоидов сопровождаются снижением их активности [6, 11]. Полученные нами данные согласуются с данными других авторов.

Белковый гидролизат, а именно аминокислотный триплет – гистидин, треонин, триптофан, не только вероятно перезапустил метаболизм гомеостаза организма норок в целом, но и выступил в роли донора по образованию заменимых аминокислот и выравниванию их по количеству: так гистидин является донором глутаминовой кислоты, нарушение метаболизма гистидина в тканях животного отражается в снижении концентрации гистидина в эритроцитах, тем самым увеличивается его содержание в сыворотке крови. Иниции- руются эти процессы тем, что тормозится реакция дезаминирования и усиливается реакция декарбоксилирования, при этом образуется биологически активное вещество – гистамин – естественный ингибитор перекисного окисления липидов.

Введение гистидина позволяет ограничить образование маланового диальдигида в тканях, приводящего к разрушению митохондрий и угнетающего процесс окислительного фосфорилирования.

Триптофан вместе с лизином образует трипептид (лизин-триптофан-лизин), который исправляет ошибки, возникающие при удвоении ДНК и возникновении различных поломок (фрагментация) в ее нитях. При нехватке этой незаменимой аминокислоты происходит выпадение шерсти у животных и нарушатся функция половых желез.

Триплет незаменимых аминокислот белкового гидролизата, поступающий путем применения его в составе базового рациона опытных групп самцов норок, инициировал, по-видимому, работу необходимых ферментов, поддерживающих равновесие концентрации молекул АТФ в спер-мии.

Созданное биохимическое равновесие метаболических процессов спермия позволяет избежать потребности в диффузии его на большие расстояния по половым путям. Отсутствие аминокислотного обогащения в базовом рационе норок приводит к морфофункциональным отклонениям половых клеток, что может отражаться не только на количестве коитусов самцов–производителей, но и на развитии эмбрионов, а также на рождении здорового приплода

Заключение. Таким образом, результаты исследования показывают, что добавление в рацион самцов норок 2 мл 15 % раствора белкового гидролизата улучшает биологическую полноценность сперматозоидов, снижает индекс фрагментации ядерной и митохондриальной ДНК, снижает частоту встречаемости патологии сперматозоидов и улучшает их активность.

В результате исследований отмечено, что между первой опытной (самцы по- лучали основной рацион + 2 мл 15 % раствора белкового гидролизата) и второй опытной группами (основной рацион + 4 мл 15 % раствора белкового гидролизата) статистическое значимое различие не установлено, следовательно, экономически эффективно добавление в рацион 2 мл белкового гидролизата.

DNA FRAGMENTATION INDEX - A MARKER OF FERTILITY