Индикация антибиотика цинкбацитрацина в кормах методом ВЭЖХ

В настоящее время организация кормления сельскохозяйственных животных основана на массовом применении биологических соединений (ферменты, аминокислоты, пробиотики и др.). Сегодня агропромышленный комплекс России имеет ёмкий рынок этих продуктов. Однако не все сельскохозяйственные производители используют кормовые добавки.

Ежегодно в животноводстве в качестве кормов используют от 40 до 50 млн. т зерна. Его доля в отечественных комбикормах составляет 70-75 %. К сожалению, более половины общего количества зерна, предназначенного для их приготовления, вводят в рационы в не переработанном виде. При таком подходе конверсия корма существенно хуже мировых показателей, а себестоимость получаемой продукции – намного выше, что снижает конкурентоспособность российского животноводства.

Выпуск микробиологических средств (а сегодня достаточно большой ассортимент кормовых добавок производят путем микробного синтеза) требует обеспеченности энергоресурсами и специальным оборудованием, в том числе установками для обработки продукта паром под высоким давлением, навыками работы в асептических условиях, наличия квалифицированных специалистов. Поэтому появление на рынке России, к примеру, антибиотиков, якобы произведенных отечественной компанией, не имеющей условий для производства, вызывает некоторое сомнение в происхождении и качестве таких препаратов. В нашей стране кормовые антибиотики относят к лекарственным сред- ствам, но это отнюдь не означает, что их не применяют как добавки и стимуляторы. Использование этих препаратов в кормлении молодняка и взрослого поголовья способствует снижению падежа, нормализации обменных процессов, повышению резистентности организма, что обеспечивает повышение продуктивности и уменьшение производственных затрат [2, 5]. Одним из разрешенных кормовых антибиотиков к использованию на территории Российской Федерации является бацилихин [6].

Действующее вещество бацилихина – полипептидный антибиотик немедицинского назначения бацитрацин, природный антибиотик, продуцентом которого является Вacillus licheniformis. Одним из преимуществ бацитрацина является то, что он не всасывается в кровь, действует в просвете желудочно-кишечного тракта и практически не накапливается в органах и тканях животных. В животноводстве разрешено использовать кормовые формы бацитрацина: бацилихин-10, бацилихин-20, бацилихин-30 и др.

В последнее время в связи с нечистоплотностью некоторых коммерческих структур и низкого уровня контроля над производителями покупатели сталкиваются с отсутствием положительного результата от применения такой продукции. И как избежать риска приобретения неэффективных кормовых добавок, единственное «преимущество» которых заключается в низкой цене?

Установлено, что при добавлении антибиотиков в корм происходит значительное сокращение отхода молодняка в результате различных заболеваний, ускорение процесса роста и развития животных и птиц и заметное (5-10 %) сокращение потребления кормов.

Комбикорма, обогащенные антибиотиками, усваиваются организмом животных намного лучше. Примерно, 15-20 % антибиотиков всасывается в желудке, 70-80 % в тонком отделе кишечника и 5-10 % в толстом отделе кишечника.

К сожалению, существующие проекты надзора не содержат требования к мониторингу использования антибиотиков.

На сегодняшний день в Российской Федерации наиболее распространенными методами определения антибиотика бацитрацина в продуктах питания являются микробиологический и иммунофер-ментный. Микробиологический метод основан на чувствительности бактерий к этому антибиотику, способности диффузии его в агаровую среду со спорами тест-микроба, препятствованию их росту с образованием прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотика в объектах устанавливают по диаметру зон ингибиции.

Тест-система «RIDAS-CREEN®Bacitracin» основана на методе иммуноферментного анализа. Она выполнена в формате микротитровального планшета и позволяет быстро и эффективно определять содержание бацитрацина в пробах пищевых продуктов.

Однако эти методы имеют ряд недостатков:

• -    низкая специфичность. В настоящее время в объектах ветнадзора используются большое количество добавок (консерванты, красители, усилители вкуса и т.д.), которые могут давать ложноположительный эффект;

• -    длительный период проведения анализа. Требуется время для выращивания спор тест-культур (1-7 суток) и для проведения самого анализа (18 часов), т.е. одно исследование занимает от 2 до 8 суток. Кроме того, для исследования необходимо постоянно поддерживать чистоту тест-культур. Одним из наиболее перспективных методов определения антибиотика бацитрацина является метод высокоэффек-

• тивной жидкостной хроматографии с масс-детектированием. Недостатками данного способа являются: применение высокотоксичного метанола в качестве подвижной фазы; использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.

В настоящее время назрела необходимость разработки высокочувствительных методов определения количественного содержания антибиотиков в кормах.

На базе ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработан воспроизводимый, прецизионный ВЭЖХ метод определения антибиотика цинкбацитрацина в кормах [1, 3, 4, 7].

Целью данных исследований стал поиск оптимальных условий пробоподго-товки и режимов хроматографирования методом ВЭЖХ на диодно-матричном (ДМД) детекторе для идентификации и индикации антибиотика цинкбацитрацина в корме.

Материал и методы исследований. Искусственная затравка корма проводилась стандартным раствором цинкба-цитрацина, с содержанием действующего вещества не менее 90 % (European Pharmacopeia Reference Standard). Образцы корма, свободные от антибиотика, были использованы в качестве контрольного материала.

Пробоподготовка. Из средней пробы или комбикормового сырья методом квартования выделяли около 100 г материала, размалывали без предварительного подсушивания и просеивали через сито. Остаток на сите измельчали и добавляли к пробе, затем перемешивали.

Из полученного материала отбирали навеску 5 г корма, экстрагировали механическим встряхиванием в течение 20 мин с 20 мл 1,5 мМ водного раствора три-лона Б и 20 мл 1 % ТХК. Раствор перемешивали 20 мин на шейкере и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин. Отбирали жидкий слой и к нему добавляли 150 мл деионизированной воды. Нераство-ренную матрицу корма обрабатывали 30 мл метанола и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Полученный верхний слой объединяли с первой фракцией и доводили объем до 200 мл деионизированной водой. Раствор перемешивали 20 мин на шейкере и фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Отбирали из полученного экстракта 10 мл в пробирку.

Очистку путем твердофазной экстракции осуществляли на картридже Oasis HLB 3 см3 х 60 мг. Предварительно картридж конденсировали 3 мл метанола и 3 мл водного раствора трихлоруксусной кислоты (рН-4,0). Полученный экстракт пропускали через картридж со скоростью 1 мл/мин. Картридж сушили на вакууме под давлением 20 мм.рт.ст. и промывали 5 мл бидистиллированной воды. Элюировали по 2,5 мл метанола 2 раза.

Элюат выпаривали под слабым током азота при 35 ⁰С до 1 мл и добавляли 2 мл раствора (0,05 М калия фосфорнокислого 1-замещенного (КН 2 РО 4 ), ацетонитрила и метанола в соотношении 40/15/45). Конечный объем использовали для ВЭЖХ анализа.

Для проведения исследований и разработки определения цинкбацитрацина применялся жидкостной хроматограф «Agilent 1100 Infiniti» с диодно-матричным (ДМ) детектором.

Разделение проводили на колонке «ReproSil ODS–AC» 18 (5 мкм) (250:4 мм).

Концентрирование и очистку экстрактов проводили методом ТФЭ на картриджах «Oasis HLB» 3 см3 х 60 мг.

Результаты исследований. Оптимальные аналитические результаты получены при использовании колонки «Reprosil ODS – AC 18» с подвижной фазой ацето-нитрил-метанол (1:3 v/v) – водным раствором КН 2 РО 4 (0,05 М рН=6,0) (60:40 v/v), скорости потока 1,0 мл/мин и температуры термостатирования 25 ⁰С. Аналитический сигнал регистрировали на длине волны возбуждения 254 нм.

На рисунках 1 и 2 представлены хроматограммы стандартного раствора цинкбацитрацина с концентрацией 0,1 мг/кг и опытной пробы, полученные методом ВЭЖХ с ДМ - детектором.

Рисунок 1 -Хроматограмма стандартного раствора цинкбацитрацина, полученная в оптимальных условиях на хроматографе «Agilent 1100 Infinity»

mAU

-2

0                        2                        4                        6                        8                       10                       12            min

Рисунок 2 – Хроматограмма цинкбацитрацина опытной пробы, полученная в оптимальных условиях на хроматографе «Agilent 1100 Infinity»

Заключение. Разработан метод ВЭЖХ определения качественного и количественного содержания антибиотика бацитрацина в кормах. По диапазону определяемых содержаний данная методика позволяет идентифицировать антибиотик в кормах на уровне предельно допустимых дифференцированных норм, вводимых при изготовлении полнорационных комбикормов, премиксов, белково-витаминных добавок.

Резюме

Проблема сохранности сельскохозяйственных животных и птицы обусловливает возрастающий год от года спрос на кормовые антибиотики. Однако существующие проекты надзора не содержат требования к мониторингу использования антибиотиков. Поэтому применение антибиотических средств несет колоссальный риск. В настоящее время назрела необходимость разработки высокочувствительных способов индикации кормовых антибиотиков в объектах ветнадзора.

В Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности разработан метод ВЭЖХ определения качественного и количественного содержания антибиотика бацитрацина в кормах.

По диапазону определяемых содержаний данная методика позволят идентифицировать антибиотик в кормах на уровне предельно допустимых концентраций.