Индикация продуктов радиолиза в облученном мясе с помощью иммунологической тест-системы на основе малослойных графенов

Под воздействием ионизирующей радиации происходит изменение атомов и молекул биологической ткани с образованием ионов и возбужденных молекул. Это так называемый процесс радиолиза, т.е. химическое превращение вещества. Вновь образующиеся продукты биологической ткани, которые по химическому составу являются свободными радикалами и окислителями и обладают высокой химической активностью, при дальнейшем связывании с молекулами биологической ткани (белки, ферменты и другие) изменяют биологические процессы в организме. Такие измененные обменные процессы с неактивными ферментными системами, не способствующие росту и делению клеток ткани биологической системы, дают пусковой эффект для образования новых химических соединений – токсинов. Эти токсины, которые в случае воздействия ионизирующей радиации называются радиотоксинами, нарушают жизнедеятельность отдельных систем или организма в целом.

Использование технологий ионизирующего облучения для сельскохозяйственных продуктов животного происхождения применяется с целью увеличить продолжительность их хранения. Ионизирующая обработка пищевых продуктов одобрена в 69 странах. ФАО, ВОЗ и Европейский комитет по безопасности продуктов питания упорядочили процесс радиационного воздействия на продукты, введя нормативные документы и даже прописали максимальную дозу воздействия облучения на продукты, при которой не теряется питательная ценность продукта, а патогенные и условно патогенные микроорганизмы перестают размножаться (10 кГр). Существует утвержденный нормативный документ – Государственный стандарт ГОСТ ISO 14470-2014 «Радиационная обработка пищевых продуктов. Требования к разработке, валидации и повседневному контролю процесса облучения пищевых продуктов ионизирующим излучением». Этот документ одобрен Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации.

Исследование продуктов питания на радиоактивность – важный элемент ветеринарно-санитарной экспертизы. Актуальность исследований объектов ветеринарного надзора сохраняется и по сей день и даже приобретает еще большую необходимость, так как контролирование образования радиоиндуцированных токсических веществ в продуктах и кормах является вопросом контроля оптимальных доз облучения при сохранении пищевой ценности таких объектов [4].

Способы обнаружения радиотоксических веществ в облученных пищевых продуктах и кормах как изобретения описаны в патентах [9, 10].

Однако    способы индикации радиотоксинов, описанные в этих патентах, имеют недостатки. В первом патенте      «Способ      обнаружения радиотоксинов в облученных пищевых продуктах» (2008) эритроциты барана, используемые в качестве иммуносорбента, высокочувствительны к внешней среде (рН, температура, присутствие химических веществ), что приводит к потере активности             эритроцитарного диагностикума. А во втором патенте «Способ индикации радиотоксинов в облученных пищевых продуктах и кормах» (2020) предлагается трудоемкий процесс очистки бентонита, в результате которого полученные частицы бентонита мало сорбционно активны, что приводит в конечном итоге к слабой чувствительности диагностикума.

В современном мире разработки из области нанотехнологий являются важной составляющей прогресса в развитии многих сфер человеческой деятельности [1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 13, 15, 16, 17].

Большой практический интерес в качестве      сорбента     представляет углеродный материал – оксид графена, имеющий уникальное строение, которое способствует сорбционному равновесию благодаря тому, что обе стороны графеновой       плоскости       могут адсорбировать [14].

Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы явилась разработка эффективного, высокочувствительного и быстрого     способа     обнаружения радиотоксина в продуктах и кормах после лучевой обработки. А также ставилась задача примененить в качестве сорбента наночастичного малослойного графена, синтезированного              методом самораспространяющегося высокотемпературного    синтеза    из биополимеров    (глюкоза,    крахмал, целлюлоза) (размеры около 10–30 нм) [5], в качестве одного из компонентов в реакции флокуляции.

Материал      и      методы исследований. Объект исследования – мясо крупного рогатого скота. Облучали его на гамма-установке «Исследователь» в дозах 10 и 16 кГр. Мощность поглощенной дозы при этом составляла 1,75-2,0 Гр/сек. Накопление радиотоксинов хиноидного происхождения проверяли на 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75 и 90 сутки после облучения, применяя АТЭД в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и АТГД в реакции графеновой флокуляции (РГФ). При конструировании АТГД в качестве иммуносорбента использовали наночастицы малослойного графена, полученные путем самораспространяющегося высоко температурного синтеза из биополимеров (глюкоза, крахмал, целлюлоза). Для получения стандартного антигена-радиотоксина гипериммунизацию кроликов проводили хиноидным радиотоксином (полученным из облученных клубней картофеля), чтобы получить противорадиационный иммуноглобулин [8]. Облучение клубней картофеля проводили на гамма-установке «Исследователь» в дозе 0,8 кГр. Для многократной иммунизации использовали кроликов живой массой 2,0-2,5 кг, которым четырехкратно вводили радиоантиген (радиотоксин), конъюгированный с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) (чтобы антиген стал полноценным) внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра с интервалом в 2 недели между введениями. На 8-ой день после последнего введения у животных брали кровь из ушной вены и получали сыворотки. Из полученных сывороток путем высаливания сульфатом аммония выделяли антирадиотоксический иммуноглобулин. Полученную глобулиновую фракцию использовали в качестве сенситина. АТГД изготавливали путём смешивания двойного объема 0,190,20 % суспензии наночастиц графена с гипериммунной противорадиационной сывороткой в соотношении 1:1. Далее в течение 30 минут при 30 °С выдерживали в термостате, затем смеси подвергали центрифугированию при 3000 об/мин в течение 7 мин с последующим 2-кратным отмыванием осадка центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. На последнем этапе изготовления диагностикума разбавляли осадок (ресуспендировали) дистиллированной водой до 0,19-0,20 %-ной концентрации без внесения в иммунохимический комплекс индикаторного компонента (метки) 0,3 %-ной метиленовой сини. Сконструированный таким образом АТГД применяли в реакции графеновой флокуляции. В качестве основных антигенов при проведении реакции использовали: специфический положительный антиген, контрольный отрицательный антиген (экстракт необлученного мяса), гетерологичный антиген (ожоговый).

Постановку РГФ проводили следующим образом. Во все лунки иммунологического планшета вливали по 0,1 см3 дистиллированной воды. Затем в 1 ряд лунок добавляли 0,1 см3 положительного антигена, во 2 ряд -отрицательный, в 3 ряд - гетерологичный антиген. В следующие ряды первых лунок планшета разливали экстракты испытуемых проб облученного и контрольного мяса. Затем двукратно раститровывали содержимое лунок до конца длинного ряда. В заключение во все лунки планшета с антигенами и испытуемыми экстрактами добавляли по

0,025 см3 АТГД. Компоненты перемешивали до получения гомогенной взвеси в лунках и оставляли при комнатной температуре плюс 22 °С на 2-4 часа.

Реакцию учитывали по 4-балльной системе аналогично серологическим тест-системам, общепринятым в иммунологии (например, РНГА, ИФА и др.).

Контроль качества мяса по содержанию радиотоксинов осуществляли по титрам РГФ облученных проб, обеспечивающих оптимальную безопасность облученного мяса.

Результат исследований. Результаты исследований показали, что спустя 1 сут после облучения в говядине появлялись радиотоксины в разведении 1:39,9 - 1:111,6, которые имели тенденцию к дальнейшему накоплению в течение первых 5 суток после облучения и достигали максимального уровня в пробах при разведении 1:99,9 -1:561,0 (это пик нарастания РТВ в облученных пробах). В дальнейшем последовало значительное снижение титров до 1:20,4 - 1:42,0 (60-е сут). В последующие сроки исследований (75-90 сут) после облучения титры радиотоксинов резко снижались и на 90 сут обнаруживались в титрах 1:3,2 - 1:4,4 при отрицательных значениях в необлученном мясе (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Динамика накопления радиоиндуцированных токсических соединений в облученном мясе с использованием РГФ

Таблица 1 – Сравнительная чувствительность РНГА и РГФ тест-систем при индикации радиотоксинов в облученном мясе

В то же время была проведена сравнительная серологическая оценка чувствительности АТБД с антительным эритроцитарным диагностикумом в определении концентрации радиоиндуцированных токсических соединений в образцах облученного мяса. Результаты исследований представлены в таблице 1. Из данных таблицы 1 видно, что антительный вариант графенового диагностикума обладает более выраженной специфичностью и активностью в сравнении с антительным вариантом эритроцитарного диагностикума.

Проведенные исследования показали, что диагностикумы АТЭД и АТГД проявляют различную активность, что подтверждается данными таблицы 1. АТЭД определяет радиотоксин в диагностических титрах (3 log2) только после 3-их суток, тогда как АТГД в этот срок выявляет его в высоких концентрациях (5,5-7,5 log2), опережая определение радиотоксина таким образом на 3-4 разведения с помощью АТГД. В срок максимального образования и накопления радиотоксина в облученном мясе (15 сут после облучения) РГФ с нанографеновым диагностикумом также превышает показатели РНГА с эритроцитарным диагностикумом (на 3-5 разведений). На более поздних сроках после облучения АТЭД не выявляет радиотоксин, тогда как АТГД в небольших количествах все еще может его обнаружить.

Заключение. Таким образом, проведенные исследования еще раз подтверждают, что при облучении пищевых продуктов образуются радиотоксические вещества (радиотоксины), образование и накопление которых можно проверить иммунохимическими реакциями (РНГА и РГФ). Количество образующихся при облучении радиотоксинов зависит от дозы облучения и сроков исследования после облучения.

Установили, что новая тест-система РГФ на основе наночастиц малослойного графена обладает большей чувствительностью, чем ее прототип – РНГА.