Индивидуальный прогноз при лейомиосаркоме тела матки I и II стадии (по критериям FIGO): комбинированная биомолекулярная и клинико-морфологическая модель 10-летней выживаемости

Лейомиосаркома тела матки (ЛМС) продолжает оставаться одной из малоизученных опухолей тела матки ввиду своей редкой встречаемости [3]. Частота ЛМС, по данным различных авторов, колеблется в диапазоне 1–1,3 % от всех злокачественных неоплазий матки и 25–60 % от всех неэпителиальных опухолей этой локализации [7, 12, 13]. До настоящего времени ввиду сложности рандомизации продолжаются дискуссии относительно важности целого ряда клинико-морфологических и биомолекулярных критериев выживаемости при этой патологии, однако единого мнения относительно предиктора прогноза пока не существует [1, 10, 11]. Вместе с тем особый интерес исследователей в аспекте научно-практических знаний вызывает использование математических моделей прогноза, включающих данные об уровнях экспрессии различных молекулярных маркеров при неоплазиях различных локализаций с целью выделения групп больных с благоприятным и неблагоприятным исходом заболевания [6]. Тем не менее исследований о возможности индивидуального прогнозирования исхода при ЛМС, основанных на многофакторной комбинированной модели, в настоящее время нет.

Целью исследования стало использование многофакторного регрессионного анализа выживаемости больных ЛМС, включающего клинико-морфологические и биомолекулярные критерии для создания модели индивидуального прогнозирования.

Материал и методы

Ретроспективно исследовали 66 случаев ЛМС и перитуморозной зоны с известным прогнозом I–II стадии по критериям FIGO [4], полученных при оперативным вмешательствах с 1997 по 2009 г. Клинические данные получали из историй болезни и канцер-регистра Алтайского края.

Патоморфологическое исследование проводили по одинаковой схеме: вырезка из центра, периферии и непосредственно прилежащего к опухоли миометрия (на одном препарате). Препараты фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине, проводили через этиловые спирты восходящей концентрации, заливали в парафин. Готовили срезы 4 мкм. При патоморфологической диагностике, кроме рутинных, использовали иммуногистохимические и гистохимические методы окраски.

Для исследования НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ на замораживающем микротоме готовили срезы толщиной 10–15 мкм. Свежезамороженные нефиксированные срезы инкубировали в субстрате соответствующего фермента: НАДН2-диафораза (IUBMB 1.6.99.1), сукцинатдегирогеназа СДГ (IUBMB 1.3.99.1) и лактатдегидрогеназа ЛДГ (IUBMB 1.1.1.27).

Активность ферментов в гладкомышечных клетках оценивали количественным методом Р.П. Нар-циссова, основанным на подсчете образованных в клетке видимых гранул формазана, при использовании n-нитротетразолия фиолетового в абсолютных цифрах. Кроме того, на свежезамороженных нефиксированных срезах опухоли толщиной 30–40 мкм, окрашенных на щелочную фосфатазу по Гомори ЩФ (IUBMB 3.1.3.1), оценивали характер и степень выраженности реакции эндотелия сосудистого русла.

Для изучения аргирофильных белков области ядрышковых организаторов срезы окрашивали AgNO3 по двухступенчатому методу Y. Daskal et al. (1980). Подсчет гранул вели на компьютерном анализаторе изображений в автоматическом режиме с помощью программы Image J 1.35. Кроме того, использовали просчет в ручном режиме. Оценивали среднее количество ядрышек на 1 ядро, их морфологический тип по морфофункциональной классификации ядрышек [5]. В классификации видов ядрышек и распределения нуклеолярного кластера гранул учитывали следующие типы [2]:

– нуклеолонемные, характерные для клеток зреющих, новообразованных, фактически недифференцированных;

– кольцевидные, характерные для зрелых клеток;

– переходные, характерные для вызревающих.

Для ИГХ реакции использовался стрептавидин-биотиновый метод с применением системы визуализации EnVision+Dual Link и BioGenex Super Sensitive Polymer-HRP Detection System, в обоих случаях использовали хромоген DAB. Первичные антитела к белкам Ki-67 (клон MIB-1), p53 (клон DO-7), Bcl-2 (клон МКА 124), BrdU (клон Bu20a), Topoisomerase IIα (клон Ki-S), HSP70 (клон W27) использовали согласно рекомендованным протоколам и системам просчета производителя с оценкой активности (%) и степени экспрессии белков (полуколиче-ственный метод).

Для определения плотности сосудов микро-циркуляторного русла (ПМЦР) оценивали все сосуды микроциркуляции с позитивно окрашенным эндотелием к белку СD31 в не менее чем 3 полях зрения при увеличении х200, площадь исследуемого объекта при этом составила 2,1 мм2. Определяли сосудистую плотность как опухоли, так и перитуморозной зоны.

Рецепторный статус оценивали при помощи антител к прогестерону и эстрогену α по методике ER/PR pharmDx 2004 [8], а опухоль считали позитивной при сумме баллов не менее 3.

При морфоденситометрическом исследовании определяли площадь ядер исследуемых клеток и на основании оптической плотности объекта вычисляли содержание Фельген-ДНК ядер при эталоне в виде малых лимфоцитов (2с). Содержание ДНК в ядрах клеток определяли на компьютерном анализаторе изображений (микроскоп Zeiss Axiostar +, план объектив 100Х/0,65, светофильтр 570 нм, цифровая интегрированная камера 2.1 MgPixel, компьютер Pentium DUO, с программой системы анализа изображения «Image J» 1.35, и «Image Tool» 3.0).

При помощи регрессионного многофакторного анализа Кокса определяли прогностическую значимость ряда клинико-морфологических критериев и биомолекулярных характеристик саркомы с выделением наиболее значимых по параметру χ2. Для оценки индивидуального прогноза использовали комбинированную модель, предложенную I. Frank et al. [9]. При определении уровня значимости критерия использовали показатель средних (допороговых) величин. Статистическую гипотезу проверяли непараметрическими методами: однофакторным тестом Краскела–Уоллиса, U-тестом Манна–Уитни в рамках программы Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

При многофакторном регрессионном анализе выживаемости больных ЛМС были определены следующие значимые факторы прогноза (в порядке убывания показателя χ2): ангиогенез и ПМЦР перитуморозной зоны (26,9), плоидность опухолевых клеток (25,9), количество AgNORs (17,6), BrdU-метка опухолевых клеток (15,2), степень зрелости ангиогенеза опухоли (15,1), степень злокачественности по критериям FNCLCC (14,1), ядерная транслокация шаперона HSP70 (11,2), уровень экспрессии Ki-67

Таблица 1

Влияние клинико-морфологических и биомолекулярных факторов на выживаемость больных ЛМС (по результатам многофакторного регрессионного анализа)

Фактор	χ2	Стандартная ошибка	Различие (р)
Клинико-морфологический фактор
Стадия по FIGO	9,4	0,5	0,002
Степень злокачественности по FNCLCC	14,1	0,7	0,00018
Возраст	6,1	1,1	0,0123
Размер опухоли	5,5	0,5	0,019
Гистотип опухоли*	3,7	1,4	0,058
Биомолекулярный фактор
Ангиогенез перитуморозной зоны	26,9	0,4	0,00001
Плоидность	25,9	0,4	0,00002
Ангиогенез опухоли*	0,02	0,5	0,8
Количество AgNORs	17,6	0,5	0,0003
BrdU-метка	15,2	0,47	0,0002
Зрелость сосудов опухоли	15,1	0,51	0,0001
Тип реакции шаперона HSP70	11,2	1,6	0,008
Экспрессия Ki-67	10,2	0,49	0,001
Экспрессия р53*	1,5	16,1	0,2
Экспрессия Bcl-2*	0,7	42,1	0,9
Экспрессия TopoII*	0,2	10,1	0,5
Экспрессия РП	9,8	0,5	0,0012
Экспрессия РЭ*	3,5	0,47	0,06

Таблица 2

Клинико-морфологические и биомолекулярные маркеры в индивидуализации прогноза при ЛМС (по данным многофакторного анализа независимых критериев прогнозав балльной системе оценки факторов)

Скорректированная выживаемость больных ЛМС в зависимости от групп различной степени риска

Маркер	Значения	Баллы
CD31 перитуморозной зоны*	До 62,4 в 2 мкм2	0
	Более 62,4 в 2 мкм2	9
Плоидность ядер*	До 9,4 с	0
	Более 9,4 с	9
Количество AgNORs**	До 22,1 гранулы	0
	Более 22,1 гранулы	3
BrdU активность**	До 6,3 %	0
	Более 6,3 %	3
Зрелость сосудов опухоли**	Преобладание зрелого ангиогенеза	0
	Преобладание незрелого ангиогенеза	3
Степень злокачественности по FNCLCC**	G1	0
	G2	2
	G 3	3
HSP70 тип реакции (транслокация)**	Цитоплазматический, ядерно-цитоплазматический	0
	Ядерно-ядрышковый	3
Экспрессия Ki-67**	До 16,2 %	0
	Более 16,2 %	3
Topoisomerase II интенсивность**	+, ++	0
	+++	3
Рецепторный статус (по РП)**	Позитивно	0
	Негативно	3
Стадия FIGO**	I	0
	II	3
Размер опухоли**	До 7 см	0
	Более 7 см	3
Максимальное количество баллов	50

Примечание: * – факторы, показатель χ2 которых более 25; ** – факторы, показатель χ2 которых менее 25.

Таблица 3

Степень риска неблагоприятного прогноза	Выживаемость			Показатель χ2
	3 года	5 лет	10 лет
I (слабая)	92,9 ± 1,8 %	92,9 ± 3,4 %	83,7 ± 6,7 %	41,9 р=0,0000013
II (умеренная)*	68,4 ± 3,4 %	44,3 ± 5,7 %	14,7 ± 4,4 %
III (высокая)*	10,8 ± 2,3 %	5,4 ± 1,7 %	0

Примечание: * – группы со значимым различием.

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. №5 (47)

• (10,2),    рецепторный статус опухоли (9,8), стадия по FIGO (9,4), возраст (6,1), размер опухоли (5,5). Часть факторов не обладала статистически значимым влиянием на прогноз и была исключена из алгоритма модели: гистологический тип, ангиогенез и ПМЦР опухоли, экспрессия р53, Bcl-2, TopoIIα и рецепторов эстрогена (табл. 1).

Следует отметить, что независимым показателем выживаемости (предиктором прогноза) стала ПМЦР перитуморозной зоны. Поскольку, кроме ПМЦР, важнейшим фактором был параметр плоидности опухоли, то целесообразным было выделение 2 групп значимых критериев: с показателем χ2 до 25 и с показателем χ2 более 25. В связи со степенью влияния критериев на выживаемость для многофакторного анализа была введена балльная система оценки, где меньшему значению изучаемого фактора (допороговому), как показателю благоприятного прогноза, присваивался 0, а при превышении порогового значения цифры были поделены согласно значимости критерия χ2 на две группы (табл. 2):

• 1.    В группе факторов χ² более 25 (максимальный балл – 9);

• 2.    В группе факторов χ² до 25 (максимальный балл – 3).

В дальнейшем высчитывали общий суммарный балл для каждого случая лейомиосаркомы индивидуально каждому пациенту. Для выделения отдельных групп риска в просчете регрессионного анализа по Коксу и для возможности рандомизации было выделено 3 группы (по уровню диапазона баллов просчета) (табл. 3):

I – от 0 до 20 баллов;

II – от 21 до 40 баллов;

• III – более 40 баллов.

Анализ выживаемости каждой группы индивидуального прогноза показал статистически значимые различия в показателях 3-, 5- и 10-летней выживаемости в I, II и III группах (табл. 3). Исходя из высокой достоверности различий, стало возможным на основании комбинированной клинико-морфологической и биомолеку-лярной прогностической модели для больных ЛМС тела матки с самым высоким показателем χ2 более 40 относительно отдельных факторов проводить оценку в баллах для каждого паци- ента с выделением больной в соответствующую набранным баллам группу риска.

Проведенное исследование показало, что независимыми факторами прогноза при ЛМС тела матки были ПМЦР перитуморозной ткани и плоидность опухолевых клеток, причем прогностическим предиктором стала ПМЦР пери-туморозной зоны. Немаловажными факторами были также (по мере убывания значимости): количество AgNORs, BrdU-метка, степень зрелости сосудов опухоли, степень злокачественности по критериям FNCLCC, ядерная транслокация шаперона HSP70, уровень экспрессии Ki-67, рецепторный статус опухоли, стадия по FIGO, возраст, размер опухоли. Все данные факторы являются основой комбинированной модели индивидуальной выживаемости с выделением 3 групп риска неблагоприятного прогноза. На основании стандартизованного подхода к анализу и установленных различий в 10-летней выживаемости 3 групп риска при χ2=41,9, р=0,0000013, что превысило значение ПМЦР практически в 2 раза, комбинированная клинико-морфологическая и биомоле-кулярная модель индивидуальной выживаемости является предиктором прогноза и способствует выделению пациентов с благоприятным и неблагоприятным исходом при ЛМС тела матки. Использование данной модели возможно при формировании групп риска практически всех локализаций злокачественных неоплазий с корректировкой значимости факторов согласно локализации опухоли.