Индукция апоптоза клеток меланомы лигандом TSPO РК11195

Меланома кожи является агрессивным злокачественным новообразованием, стремительный рост заболеваемости которой в последние десятилетия регистрируется во всем мире среди белого населения, включая страны с исторически низким уровнем этой патологии [5]. В структуре всех опухолевых заболеваний кожи меланома составляет 3–5 % и, таким образом, занимает лишь третье место по частоте встречаемости, но именно это новообразование является главной причиной смерти больных с онкопатологией кожи [1].

Несмотря на наблюдающуюся тенденцию к улучшению диагностики меланом на ранних стадиях заболевания и меланом in situ, снижения смертности при этой патологии не наблюдается. Возможно, это связано с биологически агрессивным поведением опухоли с самого начала ее гразвития. Кроме того, метастазирующая меланома прогностически крайне неблагоприятна и резистентна ко всем видам противоопухолевой терапии [3]. Считается, что в основе этого лежит особая устойчивость клеток меланомы к апоптоз-индуцирующим стимулам. Клетки меланомы имеют низкий уровень спонтанных апоптозов in vivo в сравнении с другими опухолевыми клетками и резистентны к индуцированному лекарственными препаратами апоптозу in vitro [4, 7]. Данные особенности биологического поведения меланомы обусловливают необходимость дальнейшего изучения особенностей реализации апоптоза при данном новообразовании.

Известно, что нарушение проницаемости митохондриальных пор является одним из ключевых событий в развитии апоптоза. Высвобождение апоптотических факторов из митохондриального межмембранного пространства в цитоплазму, формирование «апоптосом» и активация эффекторных каспаз являются необратимыми событиями на пути развития клеточной гибели [6].

Митохондриальные поры (МП) являются мультипротеиновым комплексом, локализованным между наружной и внутренней митохондриальной мембраной. Они формируются несколькими белками: митохондриальной гек-сокиназой, TsPO, вольтажзависимым анионным каналом (VDAC) на наружной мембране, креа-тинкиназой в межмембранном пространстве, переносчиком адениннуклеотидов (ANT) на внутренней мембране и циклофиллином D в матриксе [8]. Открытие поры инициирует апоптотическую гибель клеток, в то время как фармакологическое ингибирование предотвращает развитие клеточной смерти.

Показано, что TsPO, как один из компонентов митохондриальных пор, может модулировать их функционирование путем увеличения продолжительности открытия, что ведет к снижению мембранного потенциала [2, 8]. К классическим лигандам, связывающим TsPO и предположительно модулирующим его функционирование. относятся PK11195. В 1999 г. было показано, что специфический лиганд TsPO – РК11195 – может индуцировать апоптоз в тимоцитах. Позднее было выявлено, что более чем в двадцати различных типах клеток TsPO может демонстрировать проапоптотические эффекты. Более того, обнаружено, что TsPO обладает способностью потенцировать эффекты других проапоптоти-ческих, в том числе противоопухолевых препаратов [8].

В этой связи целью данного исследования было определение возможности активации TsPO-опосредованного апоптоза клеток меланомы кожи путем воздействия специфическим TsPO лигандом РК 11195.

Материал и методы

Клеточное культивирование. Человеческая культура клеток меланомы кожи SK-MEL-1 (American Type Cells Collection) была любезно предоставлена Московским НИИ медицинской экологии. Клетки выращивались в среде RPMI 1640 с 10 % содержанием фетальной бычьей сыворотки с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина при 37°C в CO₂ инкубаторе (5 % CO₂). Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2–4×10⁶ кл/мл за 24 ч до начала эксперимента. К суспензии клеток добавлялся TsPO лиганд РК11195 (Sigma) в концентрации 10 μmol/L, 100 nmol/L и 10 nmol/L. В контрольной группе клетки оставались без лечения. Через 72 ч клетки центрифугировали в течение 10 мин со скоростью 1,5 тыс/об., клеточный осадок промывался в холодном фосфатно-солевом буфере.

Оценка уровня апоптоза. Выраженность апоптоза оценивалась с помощью окраски акридиновым оранжевым/бромистым этидием (Gerbu Biothechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.). Определялся процент апоптотических клеток с ядром, окрашенным (полностью или фрагментарно) в оранжевый цвет. Ядра живых клеток окрашивались в зеленый цвет. Визуализация проводилась с помощью флюоресцентного микроскопа Primo Star (Carl Zeiss MicroImaging GmbH), подсчитывалось число апоптотических клеток на 100 визуализируемых клеток.

Иммуноцитохимическое исследование. После промывания клетки переносили на стекла и высушивали в парах формалина для фиксации в течение 30 мин. После этого проводилось окрашивание согласно стандартным методикам с кроличьими моноклональными антителами к TsPO (Trevigen, разведение 1:400). Для визуализации использовалась система детекции Ready-to-Use (Novocastra) и диаминобензидин (Novocastra) в качестве хромогена. Подсчет положительно окрашенных клеток производили при увеличении х400 с помощью микроскопа Olympus BX-41. Определяли процент положительно окрашенных клеток на 100 клеток.

ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Для определения уровня экспрессии TsPO использовался метод ПЦР в реальном времени. Для этой цели из клеток меланомы после инкубации с РК11195 и клеток контрольной группы выделяли РНК с помощью набора для выделения РНК «Рибо-золь-В» (AmpliSens) в соответствии с инструкцией производителя, после выделения РНК осуществлялась реакция обратной транскрипции с использованием комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens). Синтезированную в результате обратной транскрипции кДНК непосредственно использовали для постановки ПЦР в реальном времени, применяя специфичные праймеры к TsPO и β-актину в качестве эндогенного контроля (TaqMan, Applied Biosystems). Амплификацию и детекцию осуществляли методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Качественные результаты РТ ПЦР были проанализированы по методу сравнения ΔCt, который определяет амплификационный цикл, во время которого флюоресценция образца стала достоверно выше базального сигнала. Мы выполняли соответствующую оценку TsPO

Таблица

Уровни апоптоза и экспрессии TsPО в клетках меланомы SK-MEL1 после инкубации с РК11195 по результатам иммуноцитохимического исследования

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,001).

сигналов путем их нормализации к сигналам от β-актина. Для достоверного сравнения уровня экспрессии мРНК TsPO в контроле и после лечения РК11195 использовали t-критерий Стьюдента. Программа термоциклирования осуществлялась при следующих условиях: Hold 50°C – 2 мин, Hold 95°C – 10 мин, 45 циклов: 95°C – 15 сек, 60°C – 1 мин.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для определения экспрессии TsPO после лечения клеток меланомы кожи специфическим лигандом РК11195 в концентрациях 10 μmol/L, 10 и 100 nmol/L проводилось иммуноцитохимическое окрашивание клеток моноклональными антителами к TsPO. Уровень экспрессии определялся процентом положительно-окрашенных клеток. При этом наблюдалось золотистокоричневое окрашивание цитоплазмы. Показано, что после лечения TsPO лигандом РК11195 во всех концентрациях происходило достоверное увеличение уровня экспрессии белка в сравнении с контрольной группой (таблица).

Анализ экспрессии TsPO с помощью ПЦР в реальном времени в клетках меланомы кожи после воздействия лигандом РК11195 во всех концентрациях выявил также повышение уровня экспрессии мРНК, но при этом достоверное увеличение экспрессии в 3 раза происходило только после лечения РК11195 в концентрации 100 nmol/L (р<0,05). Таким образом, мы подтвердили результаты иммуноцитохимического исследования и выявили изменения уровня экспрессии TsPO в клетках меланомы кожи SK-MEL-1.

Однако при анализе полученных данных было отмечено, что РК11195 в концентрации 10 μmol/L максимально увеличивал уровень белка ТsРО в клетках меланомы, при этом экспрессия мРНК была минимальной по сравнению с другими концентрациями РК11195. Этот факт можно объяснить тем, что микромолярная концентрация РК11195 могла вызвать ингибирование экспрессии TsPO на уровне транскрипции мРНК, но при этом оказывать стимулирующий эффект на процесс рибосомальной трансляции белка TsPO. Для подтверждения данных изменений требуются дополнительные исследования.

Кроме того, был проведен анализ изменения уровня апоптоза в клетках меланомы кожи после воздействия лигандом РК11195. Было определено пятикратное повышение уровня апоптоза после лечения РК11195 во всех концентрациях, при этом значения опытной группы достоверно отличались от значений контрольной группы (таблица). Полученные данные о применении специфического лиганда РК11195 в качестве проапоптотического агента в составе комбинированной терапии злокачественных опухолей, в том числе меланомы кожи, дают надежду на успешное преодоление механизмов химиорезистентности. Повышение уровня экспрессии TsPO с параллельным увеличением уровня апоптоза в культуре клеток SK-MEL-1 после лечения TsPO лигандом РК11195 в наномо-лярной концентрации 100 nmol/L указывает на возможность использования TsPO в качестве патогенетической мишени для активации апоптоза клеток меланомы кожи.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (ККФН и НТД доп. согл. № 07/10 от 30.09.10).