Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в клетках линии V79 при длительном воздействии низкоинтенсивного Y-излучения

• ¹ Введение. Большая часть повреждений, возникающих в ДНК клеток после воздействия ионизирующего излучения (ИИ), существенно отличается по своей химической природе от эндогенных повреждений [1]. Важнейшей характеристикой радиационно-индуцированных повреждений ДНК является их сложность и кластеризация [2]. Среди повреждений ДНК, вызываемых ИИ, двунитевые разрывы (ДР) ДНК являются наиболее критическими для дальнейшей

  Ответственный автор — Осипов Андреян Николаевич Адрес: 123182, г. Москва, ул. Живописная, 46.

Тел: +79154373245.

судьбы клетки. Предполагается, что именно ДР являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения [3]. Репарация ДР происходит довольно медленно, в то время как ДР, не устраненные в ходе репарации ДНК, приводят к серьезным цитогенетическим нарушениям, гибели клеток, инактивации генов супрессоров опухолей или активации онкогенов [4]. Основные закономерности индукции и репарации ДР довольно хорошо изучены при остром, кратковременном воздействии ИИ в различных дозах [5]. Однако в реальных условиях живые организмы, как правило, подвергаются не острому, а длительному / хроническому воздействию ИИ. К сожалению, существующие в настоящее время экспериментальные данные об особенностях изменения количества ДР в клетках млекопитающих при длительном / хроническом воздействии ИИ немногочисленны и крайне противоречивы [6].

Цель работы : изучение закономерностей изменений количества ДР ДНК в клетках китайского хомяка линии V79 при длительном воздействии низкоинтенсивного γ-излучения.

Материал и методы. В работе использовали культуру фибробластов легкого китайского хомячка (линия V79). Клетки обладают довольно высокой адгезивной способностью к лабораторному пластику. Клетки культивировали в стандартной полной среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 1 % L-глютамина и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) в условиях стандартного СО₂-инкубатора при 37°C в атмосфере с 5%-м содержанием CO₂.

Облучение клеток при мощности дозы 0,1 мГр/мин проводили на специально переоборудованной для облучения культур клеток облучательной установке «Гамма-Панорама» (источник γ-излучения Сs-137).

Для анализа фокусов γ-Н2АХ использовали методику, описанную в работе [7]. Коротко: клетки на покровных стеклах фиксировали параформальдегидом (2% в трис-буфере, рН 7,4), промывали трис-буфером, пермеабилизировали холодным (–20°С) метанолом в течение 1 мин и помещали на 20 мин в трис-буфер, содержащий 4% фетальной телячьей сыворотки и 0,1 % Тритон-Х100. Слайды инкубировали с моноклональными антителами к белку γ-Н2АХ (Anti-phospho-Histone H2A.X Rabbit Monoclonal, Merck-Millipore) при 4°С в течение ночи, после чего промывали и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом (Goat anti-Rabbit IgG (H+L), FITC conjugate, Merck-Millipore), при комнатной температуре в течение 1 ч ДНК окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (0,5 мкг/мл, 5 мин). Визуализацию, документирование и обработку иммунноцитохимических микроизображений осуществляли на люминесцентном микроскопе Ахioscop-40 FL (СаrlZeiss), оснащенным видеокамерой высокого разрешения АxioCamMRс 5 (CarlZeiss) с помощью программы AxioVision 4.8 (CarlZeiss). Подчитывали не менее 100 клеток на точку.

Частоту апоптотических клеток определяли методом «ДНК-гало» [8]. Принцип метода состоит в том, что низкомолекулярные фрагменты ДНК, образующиеся в процессе апоптотической межнуклеосомной деградации ДНК, легко диффундируют в гель агарозы, образуя характерное «гало» вокруг ядерной области клетки. Коротко: 10 мкл суспензии клеток (1 млн клеток/мл) смешивали со 100 мкл 0,5%-го раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере при температуре 37ºC и наносили на предварительно покрытые 1 %-м слоем нормоплавкой агарозы предметные стекла. Лизис клеток проводили в холодном (4°С) лизирующем буфере (2,5 M NaCl, 100 мМ EDTA, 20 мМ Tris-HCl, pH 10,0, 1 % Triton X-100) в течение 2 ч. После окраски слайдов флуоресцентным красителем SYBR Green I (Invitrogen) анализ уровня клеточной гибели осуществляли на люминесцентном микроскопе Ахioscop-40 FL (Саrl Zeiss), оснащенном видеокамерой высокого разрешения АxioCam MRс 5 (Carl Zeiss).

Для анализа продукции активных форм кислорода (АФК) в клетках использовали краситель

5(6)-хлорметил-2,7-дихлордигидрофлуоресцеиндиа цетат (Invitrogen), считающийся маркером внутриклеточных АФК [9]. Этот препарат легко проникает через клеточную мембрану, в клетке гидролизуется эстеразами и далее окисляется до флуоресцирующего соединения. Суспензию клеток (1 млн/мл) в фосфатносолевом буфере (рН 7,4) инкубировали с препаратом в течение 60 мин. Измерения интенсивности флуоресценции проводили на флуориметре с длиной волны возбуждения 488 нм и эмиссией 525–530 нм.

Статистическую обработку результатов всех измерений проводили с помощью программы Statistica 7.0. Результаты представлены как среднее трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка. Для оценки достоверности отличий использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты. Для оценки изменений количества ДР ДНК использовали иммунофлуоресцентный анализ фокусов фосфорилированного корового гистона Н2АX (γ-Н2АХ). Фосфорилирование Н2АХ осуществляется киназами АТМ, АТR и DNA-PK в ответ на образование ДР и свидетельствует о его распознавании [10]. При этом образуются динамические микроструктуры, содержащие тысячи копий γ-Н2АХ, получивших в литературе название «фокусы γ-Н2АХ» [11]. Полагают, что один фокус γ-Н2АХ соответствует одному ДР ДНК [12]. Ранее нами было показано, что через 30 мин после острого облучения количество фокусов γ-Н2АХ в клетках линии V79 линейно зависит от дозы облучения [7].

Предполагается, что «пороговой» дозой для индукции репарации ДР является доза в несколько сГр [13]. В связи с этим нами проведены исследования динамики изменений количества фокусов γ-Н2АХ в диапазоне доз 3,6–43,2 сГр при мощности дозы облучения 0,1 мГр/мин. Результаты исследований, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что динамика изменений количества фокусов γ-Н2АХ при низкой мощности дозы существенно отличается от эффектов, наблюдаемых нами ранее на тех же клетках при облучении с высокой мощностью дозы (4000 мГр/мин) [7]. Если при облучении с высокой мощностью наблюдалось зависимое от дозы увеличение количества фокусов γ-Н2АХ, то при мощности дозы 0,1 мГр/мин характер изменений количества фокусов γ-Н2АХ необычен: в ранние сроки облучения (6–24 ч, дозы 3,6–14,4 сГр) наблюдается незначительное увеличение количества фокусов, в то время как увеличение времени и, соответственно, дозы облучения (48–72 ч, дозы 28,8–43,2 сГр) вызывало неожидан-

Доза, сГр

Рис. 1. Изменения количества фокусов γ-Н2АХ в клетках линии V79 при облучении с мощностью дозы γ-излучения 0,1 мГр/мин

П р и м еч а н и е : * — отличия от контроля достоверны, p<0,05

ное снижение количества фокусов γ-Н2АХ практически до контрольного уровня. Полученные результаты могут свидетельствовать в пользу гипотезы индуци-бельного характера репарации ДР в клетках млекопитающих при длительном воздействии низкоинтенсивного ионизирующего излучения.

Образование фокусов γ-Н2АХ происходит не только при индукции ДР повреждающими агентами, но и в процессе апоптоза. Показано, что киназа DNA-PK фосфорилирует гистон Н2АХ в процессе межнуклеосомной деградации хроматина [14]. В связи с этим было важно оценить возможный вклад апоптоза в индукции фокусов γ-Н2АХ при длительном низкоитенсивном облучении клеток. Результаты, представленные на рис. 2, показали, что при облучении клеток линии V79 при мощности дозы 0,1 мГр/ мин не отмечается увеличения доли апоптотических клеток в течение 72 ч облучения (рис. 2).

Другим процессом, индуцирующим образование фокусов γ-Н2АХ при длительном низкоинтенсивном облучении, является оксидативный стресс. Прямая индукция ДР при атаке ДНК свободными радикалами — довольно редкое событие, наблюдаемое при образовании близколежащих однонитевых разрывов (ОР) на противоположных нитях ДНК [9]. Известно, что соотношение ДР/ОР при атаке ДНК свободными радикалами составляет ~1/2000–1/3250, тогда как при воздействия ионизирующего излучения оно равно ~1/25. [9]. Однако ДР могут образовываться при коллапсе репликативных вилок, когда они достигают области однонитевого разрыва [10]. В результате фокусы γ-Н2АХ могут индуцироваться в клетках при повышенной продукции АФК. Действительно, результаты измерений продукции АФК в клетках линии V79, облученных при мощности дозы 0,1 мГр/мин, показывают, что характер изменений продукции АФК схож с изменением количества фокусов γ-Н2АХ в этих клетках (рис. 3).

Обсуждение. При анализе полученных нами результатов прежде всего обращает на себя внимание пороговость наблюдаемого эффекта. Снижение уровня ДР ДНК наблюдается после облучения в дозе ~15 сГр. Это наводит на мысль, что после достижения определенного количества ДР ДНК происходит активизация индуцибильных систем клеточного отклика на повреждения. Подобные результаты были получены нами ранее в экспериментах на мышах. Было показано, что при длительном воздействии низкоинтенсивного γ-излучения в дозах 14–43 сГр в начальные сроки облучения в клетках селезенки и лейкоцитах крови животных наблюдается незначительное увеличение количества ДР, после чего с увеличением продолжительности облучения и, соответственно, накопленной дозы, происходит неожиданное снижение их количества [6]. Результаты исследований Коллис и др. [15] свидетельствуют о том, что активация АТМ-киназы на повреждения ДНК и формирование фокусов γ-H2AX в клетках, облученных при низкой мощности дозы, значительно ниже, чем в клетках, подвергнутых облучению в эквивалентной дозе, но при высокой мощности дозы. Возможно, что активация систем клеточного отклика на повреждения ДНК при малом количестве ДР ДНК не происходит. Об индуцибильном характере отклика клеток на радиационно-индуцированные ДР ДНК свидетельствуют также результаты работы Грудзенски и др. [13]. Было показано, что первичные фибробласты человека не в состоянии репарировать ДР ДНК, возникающие в результате воздействия радиации в дозе

Рис. 2. Изменения доли апоптотических клеток в культуре клеток линии V79, облучаемой при мощности дозы 0,1 мГр/мин

Рис. 3. Продукция активных форм кислорода в клетках линии V79 при облучении с мощностью дозы 0,1 мГр/мин П р и м еч а н и е : * — отличия от контроля достоверны, p<0,05

Заключение. Показано, что при облучении клеток китайского хомяка линии V79 с мощностью дозы 0,1 мГр/мин в ранние сроки облучения (6–24 ч, дозы 3,6–14.4 сГр) наблюдается увеличение количества фокусов γ-Н2АХ, а в более поздние сроки (48–72 ч, дозы 28,8–43,2 сГр) — снижение практически до контрольного уровня. Наблюдаемый эффект не сопровождается изменением доли апоптотических клеток, однако результаты измерений продукции АФК показывают, что их характер схож с изменением количества фокусов γ-Н2АХ в этих клетках. Сделано заключение о том, что процессы, обусловливающие изменения количества ДР ДНК в клетках млекопита- ющих при длительном воздействии низкоинтенсивного γ-излучения, по всей видимости, сопряжены с развитием оксидативного стресса и последующей активизацией антиоксидантных защитных систем клеток.