Инфекционная активность вируса африканской чумы свиней в лабораторных образцах и пищевых продуктах при разных температурных режимах (с экстраполяцией на сохраняемость в природных условиях)

В результате эпизоотологического анализа вспышек африканской чумы свиней в первичных очагах установлено, что одна из основных причин, способствующих заносу и распространению вируса, — использование контаминированной продукции свиноводства (1, 2) или ее отходов (3, 4). Это происходит вследствие игнорирования ветеринарно-санитарных норм и правил: несоблюдения технологических условий производства продуктов и правил утилизации (переработки или хранения) боенских, пищевых и бытовых отходов; нарушения условий транспортировки и хранения готовой продукции или кормов (5). Так, по сведениям Россельхознадзора, в 2009 году на территорию Цимлянского района Ростовской области завезли мясо и фарш из неблагополучного региона. Как оказалось, продукты были 467

изготовлены из зараженной свинины и подвергнуты переработке с нарушениями ветеринарно-санитарных норм и оформления соответствующих документов (6). В октябре 2009 года в прикухонном хозяйстве войсковой части, расположенной на территории Ленинградской области, была зафиксирована вспышка АЧС. По результатам эпизоотологического расследования выяснилось, что вирус АЧС завезли из неблагополучного региона, и далее он распространялся через контаминированные пищевые отходы (7). Аналогичные вспышки на территории подсобных хозяйств, подведомственных силовым структурам, ставшие результатом использовании необез-зараженных кухонных отходов, были зарегистрированы в Ростовской (апрель, декабрь 2010 год) и Тверской (май 2011 года) областях (7). Это классический пример заноса вируса АЧС в благополучные хозяйства. Аналогичные случаи происходили ранее в странах Европы, в частности в Португалии в 1957 году, на Кубе в 1971 году, в Южной Америке (Бразилия) в 1978 году, в Бельгии в 1985 году; последний описанный случай произошел в Грузии в 2007 году (1).

Изучение путей распространения инфекции остается важным подходом для понимания эпидемиологии АЧС. В последние годы европейскими коллегами проведены исследования роли транспортных средств, кормов, предметов ухода за животными, обслуживающего персонала, (8), а также нелегальной торговли мясом (9) в связи с проблемой распространения АЧС, оценен риск заноса заболевания при импорте поголовья (10).

Однако проконтролировать или отследить все вероятные способы распространения вируса с продукцией свиноводства не всегда представляется возможным. Одна из основных проблем — определение эпизоотологически значимых направлений при разработке профилактических и ликвидационных мероприятий. Недооценка некоторых (на первый взгляд, малозначительных) аспектов приводит к существенному возрастанию масштабов ущерба от эпизоотии. Это относится к так называемому гуманитарному фактору распространения вируса АЧС и поддержания эпизоотической цепочки. Недостаточная информированность населения либо сознательное нарушение элементарных правил биобезопасности могут стать причиной крупной эпизоотии АЧС не только среди домашнего поголовья, но и в природных популяциях диких свиней. Учитывая роль гуманитарного (антропогенного) фактора в возникновении вспышек АЧС, следует признать актуальным изучение описанных путей распространения вируса.

Нами впервые экспериментально изучено влияние температуры на сохраняемость изолята вируса АЧС, циркулирующего на территории Российской Федерации, в контаминированной продукции свиноводства, кормах, а также в пробах, предназначенных для ветеринарно-санитарной экспертизы. Полученные данные также позволяют прогнозировать температурные условия, поддерживающие напряженность в природных очагах АЧС.

Цель выполненной работы состояла в изучении влияния температуры на инфекционность вируса африканской чумы свиней в субпродуктах, пищевых продуктах, комбикорме и питьевой воде.

Методика. Эксперименты проводили на 3-4-месячных подсвинках крупной белой породы с живой массой 20-30 кг. Для инокуляции использовали изолят Волгоград-Калач 2012 с исходным инфекционным титром 7,5 lg ГАЕ₅₀/см³ (получен из Государственной коллекции ГНУ ВНИИВ-ВиМ Россельхозакадемии). Подсвинков заражали кровью, содержащей вирус АЧС в титре 5,0 lg ГАЕ₅₀/см³ (1,0 мл крови вводили внутримышечно в область средней трети шеи).

Через 3 сут после заражения проводили убой животных и отбирали пробы внутренних органов (печень, почки, сердце), мяса и сала.

Солонину изготавливали из мяса инфицированных подсвинков методом мокрого посола. Мясные консервы готовили с соблюдением регламентов ГОСТ 32125-2013 «Консервы мясные. Мясо тушеное. Технические условия». Сало консервировали сухим посолом согласно типовой технологии по ОСТ 49 38-85 «Продукты из шпика свиного. Технические условия».

При изучении инфекционности вируса АЧС и его генома в кормах использовали комбикорм свиной следующего состава (%): ячмень — 40, пшеница — 21, овес — 10, отруби пшеничные — 10, мука ячневая — 11, хлопок шротный — 5, мука хвойная — 0,5, мел — 0,7, соль поваренная — 0,1. Навески комбикорма (по 10 г) контаминировали вирусосодержащей кровью (изолят Волгоград-Калач 2012), предварительно разведенной в питательной среде ГЛА (гидролизат лактоальбумина) в соотношении 1:10 до конечного инфекционного титра 7,0 lg ГАЕ50/см3, и высушивали при комнатной температуре в течение 8-12 ч. Для исследования образцов водопроводной воды (90 мл, рН 7,1-7,2) их также контаминировали вирусосодержащей кровью (изолят Волгоград-Калач 2012, инфекционный титр 7,5 lg ГАЕ50/см3, объем инокулята 10 мл).

Все приготовленные образцы разделяли для дальнейшего хранения при разных температурных режимах: 22-25 ° С (комнатная температура); 4-6 ° С (условия бытового холодильника); - 16^ - 20 ° С (температура морозильной камеры). Через каждые 5 сут отбирали пробы для определения титра вируса в реакции гемадсорбции (РГАд) и выявления ДНК возбудителя в ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Вирус выделяли в первичной культуре клеток костного мозга свиньи (ККМС) в течение 5 сут в двух последовательных пассажах. Зараженную культуру клеток инкубировали при 37,0±0,5 ° С в течение 3-5 сут. Результаты учитывали по наличию гемадсорбции. Постановку РГАд осуществляли по стандартной методике (11). Титр вируса (ГАЕ₅₀/см³) рассчитывали по методу Рида и Менча.

При молекулярно-генетических исследованиях подготовку образцов, выделение нуклеиновых кислот, постановку ПЦР-РВ и учет результатов проводили с использованием тест-системы для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени (ВНИИВВиМ, г. Покров) в соответствии с прилагаемой инструкцией (12).

Результаты. Выбранные для хранения образцов температуры соот- ветствуют естественным погодным условиям, характерным для разных вре- мен года: 22-25 °С — летняя температура в средней полосе России,

-16^-20 °С типичны для зимнего периода. Температура 4-6 °С, как прави- ло, поддерживается в тамбуре или кормокухне свинарников в зимнее время.

1. Сроки выявления вируса африканской чумы свиней и фрагментов его генома в субпродуктах и инфицированных пищевых продуктах при температуре хранения 22-25 ° С

Проба	РГАд	ПЦР-РВ
Солонина	+ (16 сут)	+ (28 сут)
Сало	н.и.	+ (28 сут)
Сердце	н.и.	+ (28 сут)
Почка	н.и.	+ (28 сут)
Печень	+ (16 сут)	+ (56 сут)

Тушенка

П р и м е ч а н и е. РГАд — реакция гемадсорбции, ПЦР-РВ — ПЦР в реальном времени. Указаны крайние сроки наблюдения; н.и. — не исследовали; «+» и « - » — соответственно положительный и отрицательный результат.

Известно, что гемад-сорбирующими свойствами обладают, как правило, все вирулентные штаммы АЧС, что характеризует их инфекционную активность по отношению к животным (13). Поэтому при интерпретации полученных результатов мы расценивали гемадсорбцию как подтверждение наличия инфекционного вируса.

Как видно из данных таблицы 1, в образцах пищевых продуктов, заложенных на хранение при комнатной температуре, инфекционный вирус АЧС выявляли с 1-х по 16-е сут (максимальные сроки хранения с положительными результатами исследований), а фрагменты ДНК обнаруживали до 28-х сут (в печени — до 56 сут) в зависимости от исследованного образца. Это объясняется активными автолитическими и гидролитическими процессами, происходящими в сырых мясопродуктах при температуре 22-25 °С. Как следствие, серологические методы исследования таких образцов малоэффективны. Необходимо принять во внимание, что длительное хранение мясопродуктов при положительных температурах (более 12 ч), за исключением свеже-охлажденных (предпродажное хранение), запрещено санитарными нормами и правилам. В тушенке, приготовленной из инфицированного свиного мяса, вирус и фрагменты его генома не обнаруживались в течение всего срока исследований (56 сут) (см. табл. 1).

В условиях бытового холодильника (4-6 ° С) (табл. 2) вирус АЧС сохранял инфекционные свойства в солонине в течение 60 сут (срок наблюдения) и обнаруживался в титре 3,0-1,5 lg ГАЕ₅₀/см³, тогда как в пробах сала (соленый шпик) вирус не выявили. Геном вируса АЧС сохранялся в пробах шпика и солонины при температуре 4-6 ° С в течение всего срока исследования (60 сут).

2. Титр вируса африканской чумы свиней (lg ГАЕ₅₀/см³) и выявление фрагментов его генома в ПЦР-РВ в инфицированных пищевых продуктах в зависимости от сроков хранения при температуре 4-6 ° С

Продукт	Число проб	1 сут	10 сут	20 сут	30 сут	40 сут	50 сут	60 сут
Солонина (мясо)	14	3,0/+	3,0/+	3,0/+	2,5/+	2,0/+	2,0/+	1,5/+
Соленый шпик	14	0,0/+	0,0/+	0,0/+	н.и./+	н.и./+	н.и./+	н.и./+
Тушенка	14	0,0/ -	0,0/ -	0,0/ -	н.и./ -	н.и./ -	н.и./ -	н.и./ -

П р и м еч а ни е. Титр вируса определяли в реакции гемадсорбции (РГАд) с использованием культуры клеток костного мозга свиньи, н.и. — не исследовали. ПЦР-РВ — ПЦР в реальном времени, «+» и « - » — соответственно положительный и отрицательный результат в ПЦР-РВ.

При выделении вируса АЧС и выявлении его генома в пробах тушенки получили отрицательный результат (см. табл. 2). Очевидно, что длительное воздействие высоких температур, применяемых согласно ГОСТ в технологическом процессе, разрушает вирус АЧС и его ДНК.

3. Титр вируса африканской чумы свиней (lg ГАЕ₅₀/см³) и выявление фрагментов его генома в ПЦР-РВ в контаминированном комбикорме и воде в зависимости от температуры и сроков хранения

Образец	Число проб 1 сут 5 сут	10 сут 20 сут 30 сут 40 сут 50 сут	60 сут
Комбикорм	Температур 20        1,0/+   0,0/+	а хранения 22-25 ° С 0,0/+    н.и./+   н.и./+   н.и./ -    н.и./ -	н.и./ -
Вода	20       5,5/+   4,0/+	3,5/+    3,0/+    2,5/+    2,0/+    1,0/+	0,0/+
Комбикорм	Температура хранения 4-6 ° С 20       3,0/+ н.и.    2,5/+     1,5/+    1,0/+    0,0/+    0,0/+		0,0/+
Вода	20        5,5/+ н.и.	4,5/+    4,0/+    3,5/+    2,0/+    1,0/+	1,0/+

П р и м еч а ни е. Срок наблюдения — 60 сут. Титр вируса определяли в реакции гемадсорбции (РГАд) с использованием культуры клеток костного мозга свиньи, н.и. — не исследовали. ПЦР-РВ — ПЦР в реальном времени, «+» и « - » — соответственно положительный и отрицательный результат в ПЦР-РВ.

В боксовом помещении, в котором хранили образцы комбикорма и водопроводной питьевой воды, концентрация хлора в воздухе составила 0,8 мг/м3, относительная влажность воздуха — 50-70 %. В этих условиях при комнатной температуре вирус АЧС сохранял инерционность в комбикорме до 5 сут (табл. 3). Вероятно, инактивация вируса АЧС в более поздние сроки обусловлена воздействием многочисленных химических составляющих комбикорма и его высокой адсорбционной способностью. В пробах воды инфекционный вирус АЧС выявляли в течение 60 сут (срок наблюдения). Геном вируса АЧС не обнаруживался в комбикорме, начи-470

ная с 40-х сут. Возможно, это также связано с вирулицидным воздействием химических составляющих примесей комбикорма. При комнатной температуре в пробах водопроводный воды геном вируса АЧС выявляли в течение всего срока исследования (60 сут).

При температуре бытового холодильника вирус АЧС был обнаружен в титре 3,0-1,0 lg ГАЕ₅₀/см³ в контаминированном комбикорме с 1-х по 30-е сут (при сроке наблюдения 60 сут). В пробах воды его выделяли в течение 60 сут в титре 5,5-1,0 lg ГАЕ₅₀/см³ (в зависимости от срока хранения). Геном вируса АЧС в пробах контаминированного комбикорма и водопроводной воды при этом выявляли в течение всего срока наблюдения (60 сут). Следовательно, при температуре окружающей среды 4-6 ° С контаминированный комбикорм и вода могут представлять инфекционную опасность более 30-60 сут.

Во всех пробах (мясопродукты, ливер, комбикорм и вода), хранившихся при отрицательных температурах, на протяжении всего периода исследований (60 сут) вирус АЧС сохранял инфекционную активность и были выявлены фрагменты его ДНК.

Таким образом, представленная нами работа — это первое исследование влияния температуры на изолят вируса африканской чумы свиней, циркулирующий на территории Российской Федерации, в продукции свиноводства и кормах. Важность полученных результатов определяется также тем фактом, что в настоящее время вспышки заболевания регистрируют на ранее благополучных территориях как у домашних свиней, так и среди диких кабанов.

Возможные пути распространения вируса АЧС многочисленны — через скармливание пищевых отходов (2, 13), транспортные средства, корма для животных, обслуживающий персонал или загрязненные предметы ухода (8, 14). Согласно исследованиям, проведенным в Дании и Нидерландах, используемый транспорт был назван одним из наиболее важных способов распространения классической чумы свиней (КЧС) (15, 16). Оценивалась передача болезней животных посредством используемого транспорта в конкретных регионах или странах (15, 16) либо через нелегальную торговлю мясом (9). Другие исследования, выполненные в Дании, Нидерландах, США и Великобритании, были направлены на определение уязвимых популяций животных при скармливании им пищевых отходов (17-19). В недавних публикациях обсуждается риск заноса АЧС при импорте свиней (10). Наиболее значимыми антропогенными факторами распространения АЧС признаются нелегальная торговля свининой и использование пищевых отходов в кормлении животных (20-22). Кроме того, дополнительные риски возникновения и распространения болезни создает большое число личных подсобных хозяйств при низком уровне их биологической безопасности.

Ранее испанскими исследователями при выявлении вируса АЧС в мясопродуктах было показано, что он может сохраняться в течение нескольких недель или месяцев в замороженном (23), свежем или сыром, а также в соленом высушенном мясе (24, 25), что согласуется с полученными нами данными.

При экстраполяции результатов наших исследований на природные и сельскохозяйственные объекты следует акцентировать внимание на необходимости соблюдения элементарных норм общежития, учитывая тот факт, что вирус в благоприятных для него условиях сохраняет вирулентность более 2 нед. К нарушениям, контроль за которыми часто не включен в компетенцию ветеринарных служб и соответствующим образом не регламентирован, относятся несвоевременная уборка мусора на территориях отдыха граждан или отсутствие оборудованных точек складирования бытовых отходов, спонтанные свалки, возникающие по обочинам дорог и окраинам населенных пунктов, в лесных массивах, кормление домашних свиней не подвергнутыми термической обработке пищевыми отходами, нелегальная утилизация и захоронение боенских отходов. Все эти действия приводят к заражению свиней и возникновению новых вспышек АЧС.

Итак, в продуктах, полученных от животных, больных африканской чумой свиней (АЧС), и в пробах контаминированной вирусом АЧС воды инфекционный вирус и фрагменты его генома сохраняются при 2225 ° С (температура окружающей среды в весенне-летне-осенний период) более 2 мес, на основании чего можно судить об их высокой инфекционной опасности в очаге болезни и вероятности участия в распространении инфекции за его пределы. При возникновении вспышки АЧС в зимний период срок сохранения высокой инфекционной опасности продуктов, полученных от больных АЧС свиней, и контаминированной вирусом воды в очаге болезни, а также распространения вируса за его пределы увеличивается на период, соответствующий времени воздействия отрицательной температуры. Учитывая, что в комбикорме ДНК вируса АЧС сохраняется более 60 сут, в логистике кормов необходимо исключить возможное нелегальное перемещение за пределы угрожаемой по АЧС зоны. При изготовлении пищевых продуктов из свинины согласно технологическим условиям (ГОСТ 32125-2013 «Консервы мясные. Мясо тушеное. Технические условия») происходит полная стерилизация сырья, при этом исключается возможность сохранения не только вируса АЧС, но и фрагментов его генома. Места несанкционированного сброса бытовых или пищевых отходов, неучтенные или необорудованные объекты их утилизации, находящиеся на территории эпизоотического очага или угрожаемой по АЧС зоны, могут стать территориями сохранения вируса АЧС как участки, не охваченные противоэпизоотическими мероприятиями и плановой дезинфекцией.