Инновационная технология управления процессами свободно-радикальной защиты рыб на ранних этапах онтогенеза

В условиях критического снижения рыбных запасов внутренних водоемов аквакультура рассматривается в качестве одного из надежных источников увеличения рыбной продукции. Лежащее в ее основе товарное выращивание гидробионтов представляет собой значительную часть сельскохозяйственного производства продуктов питания и является важнейшим механизмом регулирования экономики, средством реализации социальных и экологически значимых проектов [9]. Уже не вызывает сомнения, что в ближайшем будущем удовлетворение все возрастающих потребностей населения в рыбопродуктах будет осуществляться преимущественно за счет аквакультуры. В передовых странах, на долю выращенных в условиях специализированных предприятий приходится около половины потребляемого объема рыбопродуктов, что определяет актуальность развития данного направления в обеспечении продовольственной безопасности страны. Повышение роли научных исследований в практическом рыбоводстве требует внедрения новых конкурентоспособных технологий [9]. Современные методы и подходы аквакультуры направлены на снижение влияния неблагоприятных факторов среды, создание максимально комфортных условий для эмбрионального развития рыб и рассматриваются как составная часть управления процессами онтогенетического развития. Недостаточность информации в отношении реализации механизмов адаптации эмбрионов рыб к «технологическим» нагрузкам явилось основанием для выяснения роли свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) в осуществлении генетически детерминированной программы эмбрионального развития рыб в условиях аквакультуры.

Цель исследования – изучить возможности управления свободно-радикальными процессами в организме рыб на ранних этапах эмбрионального развития в условиях аквакультуры с использованием антиоксиданта нового поколения «Тиофан».

Материал и методы исследования. Особенности развития эмбрионов карпа на ранних сроках развития изучали на нативных и гистологических препаратах в проходящем свете с использованием комплекса оптико-структурного анализа «Olimpus BBS». В ходе эксперимента всю икру разделили на две группы. В контрольной группе обесклеивание икры производили молоком из расчета 0,5 л молока на 8 л воды. В опытной группе обесклеивание икры осуществлялось 1%-м масляным раствором серосодержащего антиоксиданта нового поколения «Тиофан» в составе высокодисперсной эмульсии из расчета 0,5 л раствора на 8 л воды. Все исследования были проведены в десяти повторах. В ходе инкубации на всем протяжении эксперимента соблюдались технологические требования, регламентируемые соответствующими инструкциями [10].

Абсолютное содержание биогенных элементов – кальция, меди, цинка, железа, марганца, калия и натрия – в гомогенатах икры определяли методом атомно-эмиссионного анализа с индуктивно связанной плазмой [5]. Локализацию кальция в клетках эмбрионов определяли методом гистохимического анализа по Крэтену [6].

Параметры окислительного стресса и активность ферментов антиоксидантной защиты рыб в гомогенатах икры определяли спектрофотометрически, при соответствующей длине волны. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение. Наличие в составе липидов икры рыб высокого содержания моно- и полиненасыщенных жирных кислот, которые являются легкоаутооксидабельными компонентами, определяет возможность развития реакций СПОЛ при изменении условий внешней и внутренней среды [1]. В аквакультуре получение половых продуктов от производителей нефизиологическим способом, а затем искусственное оплодотворение икры на воздухе, могут сопровождаться ее гипероксигенацией и, как следствие, повышением уровня СПОЛ. Выдвинутое предположение доказывается результатами биохимического анализа. Уровень первичных продуктов СПОЛ – диеновых конъюгатов (ДК) в гомогенатах неоплодо-творенной икры на воздухе статистически достоверно превышает данный показатель в аналогичных образцах икры, полученной от самок в воде (рис. 1). При этом в образцах икры, полученной от самок в воде, активность каталазы (КАТ) ниже, чем в образцах икры, изъятых от производителей на воздухе. Полученные результаты позволяют считать, что в условиях аквакультуры технологические процессы получения половых продуктов на воздухе и сухой метод оплодотворения способствуют развитию в икре рыб окислительного стресса (ОС). Увеличение активности КАТ можно рассматривать как адаптивную реакцию на повышение СПОЛ в яйце, направленную на защиту молекул органических веществ икры от активных кислородных метаболитов (рис. 1). Следовательно, при традиционной технологии аквакультуры уже на ранних этапах эмбрионального развития в яйце происходит изменение активности метаболических процессов, требующих перераспределения трофического материала и энергетических ресурсов, направленных на антирадикальную защиту органических компонентов икры.

Как известно, после оплодотворения икры и запуска генетически детерминированной программы развития происходит активация яйца [2, 3]. Этот процесс сопровождается каскадом катаболических реакций с вовлечением в окислительный процесс органических субстратов икры. Результаты биохимического анализа гомогенатов икры, полученной ex tempore после оплодотворения, позволяют считать, что повышенный уровень активности КАТ блокирует развитие СПОЛ и снижает содержание ДК (рис. 1).

Рис. 1. Интегральные показатели активности свободнорадикального перекисного окисления липидов при получении икры различными способами. Примечание: статистически достоверные различия между показателями контрольной и опытной групп (*р≤0,05, **р≤0,01, *** р≤0,001)

Таким образом, при традиционной технологии искусственного разведения рыб высокий уровень СПОЛ вызывает напряжение несовершенной системы антиоксидантной защиты рыб и развитие ОС на ранних этапах онтогенеза. Возможность управления данными процессами оценивалась при использовании антиоксидантных соединений в составе масляной эмульсии при обесклеивании икры.

Результаты исследования показали, что использование полифункционального серосодержащего антиоксиданта нового поколения «Тиофан» в период обесклеивания икры способствует сохранению высокой активности КАТ в ее гомогенатах по сравнению с контролем во временном интервале от 40 мин до 10 ч развития эмбрионов (рис. 1).

Рис. 2. Исследование активности каталазы на ранних этапах развития эмбрионов зеркального карпа. Примечание: статистически достоверные различия между показателями контрольной и опытной групп (*р≤0,05, **р≤0,01)

Полученные данные позволяют считать, что реализация антиоксидантом «Тиофан» своих специфических свойств обеспечивает ограничение СПОЛ, способствует рациональному расходованию КАТ и собственных антиоксидантных соединений яйца. В исследуемый временной интервал развития эмбрионов, а именно: от начала дробления и до наступления эпиболии (10 ч) – снижение активности данного фермента на сроке 10 ч эмбриогенеза, вероятно, связано с истощением естественных антиоксидантных соединений, прежде всего, каротиноидов, локализованных в икре (рис. 2).

Рис. 3. Исследование первичных и вторичных продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов на ранних этапах развития эмбрионов зеркального карпа. Примечание: статистически достоверные различия между показателями контрольной и опытной групп (*р≤0,05, **р≤0,01)

Исследование содержания продуктов СПОЛ в гомогенатах икры контрольных и опытных образцов показало, что в динамике индивидуального развития от 40 мин до 7 ч отмечается повышение уровня ДК и снижение МДА (рис. 3). С нашей точки зрения, повышение содержания первичных продуктов СПОЛ является следствием интенсивного расходования трофического материала икры на обеспечение морфогенетических процессов. В этой связи можно полагать, что чем интенсивнее развитие эмбрионов, тем выше СПОЛ. Несмотря на его высокий уровень в образцах икры опытной группы, активность КАТ остается более высокой по сравнению с контролем в течение данного периода, что указывает на отсутствие ОС [4]. Снижение уровня вторичных продуктов СПОЛ в икре обеих групп можно объяснить ограничением свободнорадикальных процессов за счет реализации механизмов антиоксидантной защиты. Сравнительный анализ опытных и контрольных образцов показал, что через 10 ч после применения антиоксиданта «Тиофан» активность КАТ в гомогенатах икры опытных образцов оставалась статистически достоверно выше, а содержание первичных продуктов СПОЛ имело достоверно низкий показатель по сравнению с контролем. Представленный анализ позволяет сделать важное заключение о возможности управления свободнорадикальными процессами на ранних этапах онтогенеза рыб за счет использования антиоксидантных соединений.

Доказательство более высокого уровня развития эмбрионов в опытной группе по сравнению с контролем основывается на результатах морфологического анализа. На нативных препаратах икры в проходящем свете отчетливо заметно, что эмбрионы контрольной группы находятся на стадии мелкоклеточной морулы, а эмбрионы опытной группы в тот же промежуток времени – на стадии эпиболии (рис. 4). По данным морфометрического анализа, диаметр икры и ширина перивителлинового пространства в контрольной группе превышали соответствующие значения опытных образцов (табл. 1). Данные показатели отражают интенсивность набухания икры и уровень обменных процессов эмбрионов с окружающей средой.

Рис. 4. Икра зеркального карпа через 10 часов после оплодотворения: А - контрольная группа; Б - опытная группа. Нативный препарат. Ув. 40 х.

Таблица 1

Морфометрическая характеристика икры зеркального карпа через 40 мин после оплодотворения

Группа	Диаметр икры, мкм	Диаметр желтка, мкм	Площадь желтка, мм2	Высота бластодиска, мкм	Ширина перивителли-нового пространства, мкм
Контроль	1850,97±19,6***	1307,99±37,6	1341,12±76,17	183,92±15,7	220,94±19,9*
Опыт	1730,14±11,9	1327,88±36,8	1400,86±78,60	163,36±36,2	148,28±26,08

Примечание: статистически достоверные различия между показателями контрольной и опытной групп (*р<0,05, ***р<0,001).

Считается, что чем больше перивителлиновое пространство, тем более интенсивно протекают процессы обмена организма эмбрионов с внешней средой [2, 3]. Увеличение ширины перивителлинового пространства в контрольных образцах икры по сравнению с опытными позволяет считать, что обменные процессы, а следовательно, и развитие эмбрионов данной группы должны протекать более интенсивно, чем в опытной группе. Это противоречит полученным результатам биохимического анализа.

Рис. 5. Кальций в канальцах оболочки икры: А – контрольная группа; Б – опытная группа. Реакция на кальций по Кретэну. Ув. 400 х.

Опровержением вышеизложенной гипотезы служат данные гистохимического и атомно-эмиссионного анализов. На рисунке 5 отчетливо видны ионы Са2+ в канальцах оболочки икры контрольной группы. Согласно данным таблицы 2, содержание Са2+ в образцах икры контрольной группы достоверно выше, чем в икре опытной группы. Установлено, что АКМ влияют на фазовое состояние липидного бислоя мембран, усиливают гидратацию клетки, нарушают проводимость мембран для ионов и других молекул [8]. В этой связи можно полагать, что при традиционной технологии аквакультуры интенсивность СПОЛ приводит к повреждению структур оболочки икры и плазматической мембраны яйца, увеличению содержания Са2+ в клетке и повышению активности Са2+-зависимых протеолитических и липолитических ферментов, и как следствие – активации СПОЛ. Доказательством повреждения липидного бислоя мембран в икре контрольной группы являются изменение Na+/K+ гомеостаза, повышение гидратации икры и ее чрезмерное набухание (табл. 2) [7, 8].

Содержание биогенных катионов в икре карпа через 40 мин после оплодотворения

Таблица 2

Группа	Массовая доля, мг/кг
	Кальций	Натрий	Калий
Опыт	57,2±6,32*	408±50,25	735±62,12
Контроль	105,8±21,43	505±38,16	924±73,33

Примечание: статистически достоверные различия между показателями контрольной и опытной групп (*р≤0,05).

В последующие сроки наблюдения темпы дробления в опытной группе опережают контрольную группу (рис. 6) и закономерность более высоких темпов развития эмбрионов опытной группы сохраняется на протяжении всех исследуемых сроков исследования.

Рис. 6. Икра зеркального карпа через 1 ч после оплодотворения: А – контрольная группа; Б – опытная.

Нативный препарат. Ув. 40 х.

Б

Таким образом, использование серосодержащего антиоксиданта нового поколения «Тиофан» позволяет оптимизировать расход собственных антиоксидантных соединений, запасенных в яйце. Возможность их рационального использования должно обеспечить стабильность метаболических процессов, направленных на рост, развитие и дальнейший переход развития эмбрионов от гаструляции к органогенезу. Полученные результаты позволяют считать, что антиоксидант «Тиофан» не является стимулятором роста, а лишь тонким инструментом настройки метаболических процессов. Использование разработанной технологии позволила увеличить выживаемость эмбрионов в опытной группе через 7 ч после оплодотворения на 12,87 % по сравнению с контролем.