Интеграция экспрессии генов, регулирующих нейрогенез, в процессе фиксации пространственного памятного следа

В настоящее время формирование пространственной памяти рассматривается как каскадный процесс, который включает в себя ряд этапов: приобретение навыка, консолидация и реконсолидация, а также извлечение памятного следа с его последующим угашением [1]. Недавние исследования молекулярной основы данных процессов показали, что в реализации процессов памяти участвуют многочисленные сигнальные молекулы, которые могут включать или переключать молекулярные пути реализации определенных этапов формирования пространственной памяти [2]. Применение генетического подхода, наряду с фармакологическими манипуляциями [3] и парадигмами обучения [4], способствовало выявлению определенных церебральных структур, а также молекулярных механизмов и белков, участвующих в формировании пространственной памяти. В этой связи, структурнофункциональные исследования транскрипционной активности генов нервных клеток особенно информативны при определении региональных и молекулярных особенностей протекания различных этапов формирования памяти [5]. В результате исследований процесса транскрипции белков в условиях обучения животных в водном лабиринте в дополнение к изменениям в экспрессии ранних генов [6] была также обнаружена динамическая картина изменения экспрессии поздних генов при формировании пространственной памяти [7]. На современном этапе дальнейшее изучение вклада генома в становление долговременной памяти продолжает оставаться актуальной задачей. Кроме того, понимание роли мРНК и синтеза белка в этом процессе, несомненно, облегчат дальнейшее исследование процессов консолидации и реконсолидации памяти, а также ее извлечения и угашения, как в нормальных, так и патологических состояниях. Интересно отметить, что функциональные свойства конкретных областей мозга определяются также в значительной степени генами, которые экспрессируются в отдельных нервных клетках. Отмечается, что во время развития мозга, эти механизмы динамически регулируются [8]. Субклеточные процессы индукции и экспрессии генов, особенно в гиппокампе, скорее всего, лежат в основе навигационного обучения и формирования пространственной памяти [9]. Тем не менее, транскрипционные процессы в гиппокампе, вероятно, могут варьироваться в зависимости от активности генов в других областей мозга, таких как кора головного мозга и мозжечок, но они, вероятно, также могут изменяться при трансформации двигательной активности животных [7]. Было продемонстрировано, что в процессе формирования пространственной памяти участвует гиппокамп [10], причем далее необходима последующая транслокация памятного следа в кору мозга для долговременной его консолидации [7]. В этот процесс также вовлечен мозжечок, хотя традиционный взгляд на основные функции мозжечка состоит из регулирования двигательной координации, баланса и моторной речи. В дополнение к координации двигательной активности мозжечок вовлечен в моторное обучение и более высокие познавательные функции, но схемы его участия в формировании когнитивных функций изучены недостаточно, хотя и имеются свидетельства анатомической и функциональной связи, поддерживающие взаимодействие мозжечка и гиппокампа [11]. В этом контексте долговременная депрессия мозжечка может поддерживать общий сенсорный процесс адаптации, разделяемый как функциями моторного, так и пространственного обучения [12]. Одновременной анализ экспрессии генов-регуляторов нейрогенеза в гиппокампе, коре мозга и мозжечке будет представлять интерес при исследовании потенциального участия процессов нейрогенеза лежащих в основе формирования пространственной памяти [13,14]. Ранее нами была показана картина экспрессии ге- нов, вовлеченных в регуляцию нейрогенеза, в отдельных областях мозга у нативных (интактных) взрослых крыс [15]. Особенно интересно, что экспрессия ряда генов-регуляторов нейрогенеза, например, генов Ascll, и S100a6 была наиболее выраженной в изученных структурах мозга, поэтому для исследования функционально-региональной интеграции экспрессии генов при формировании пространственной памяти в настоящей работе, мы сосредоточились на тех этих генах, которые играют ключевую роль в регуляции процессов нейрогенеза у взрослых животных.

Цель настоящей работы состояла в сравнительном исследовании уровня транскрипционной активности генов Ascll ( Mash 1) и S100a6 в гиппокампе, префронтальной коре и мозжечке взрослых крыс Wistar при формировании гиппокамп-зависимой пространственной памяти.

Материалы и методы.

Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде и 12 часовом световом режиме. При работе с мышами соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/EEC об использовании животных для экспериментальных исследований. Исследование проводили с использованием взрослых самцов крыс Wistar весом 220±20 г (n=30). Крысы были разделены на три группы: группа 1 - нативные крысы (n = 10), группа 2 - активные контрольные (принудительно плавающие) крысы (n=10), группа 3 - обученные крысы в водном лабиринте (n=10). Поведенческие эксперименты проводили с использованием пространственного водного лабиринта Морриса (Columbus Instruments, USA). Экспериментальный протокол составлен таким образом, что время плавания в группе активного контроля соответствовало времени, проведенному в воде обучавшимся животным, т.е. каждому обучавшемуся животному по времени и паттерну плавания соответствовала одна “контрольная” особь. Через 24 ч по окончании поведенческих экспериментов всех животных декапитировали и извлекали на холоду (+4ºС) структуры мозга: гиппокамп, префронтальную кору и мозжечок, которые использовали для изучения экспрессии генов Ascl1, S100a6 методом ПЦР в режиме реального времени по описанному ранее протоколу, применяя в качестве референтного - ген в-актина для последующего расчёта относительно уровня экспрессии изучаемых генов по методу 2-AACt [15]. Экспрессия генов Ascll, S100a6 в 2 и 3–й группах была оценена относительно интактных животных. Статистическую обработку полученных результатов проводили по алгоритмам программы “Statistica 7,0”. При сравнении нескольких независимых выборок применяли однофактор- ный непараметрический дисперсионный анализ по методу Крускалла-Уолиса (Н-критерий) с последующим post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Данные представлены в виде M±m. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.

Результаты и обсуждение.

В поведенческих экспериментах по формированию долговременной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса среднее время для достижения платформы у крыс во втором и последующих сериях было постепенно ниже, чем в первом исследовании (Р<0,01 и Р<0,05 соответственно). Однако до конца последнего испытания на четвертый день обучения среднее время платформы составляло менее 10 секунд, что свидетельствует о стабильной долговременной пространственной памяти.

Сравнивая средние значения для 2-го, 3-го и 4го испытаний с первым испытанием в каждый конкретный день, было обнаружено следующее значение различий в среднем времени достижения платформы: 1-й день - 2-е испытание = P<0,05, 3-й и 4-й испытания = P<0,01; 2-й день - 4-е испытание = P <0,05; 3-й день - 2-е испытание = P <0,05, 3-е и 4-е исследования = P <0,01; 4-й день - 2-й, 3-й и 4-й испытания = P<0,01. Анализ группового времени достижения платформы животными в водном лабиринте показал следующие существенные отличия: в дни 2 и 4 время достижения платформы для первых испытаний значительно отличались от первых испытаний в дни 1 и 3, соответственно (Р<0,05). Общие показатели для всех временных испытаний в дни 2, 3 и 4 значительно отличались от таковых в предыдущие дни, соответственно (P<0,05). Так как, время достижения платформы в конце 4-го испытания на четвертый день обучения составляло менее 10 секунд, это указывало на установление стабильной долговременной пространственной памяти.

В молекулярно-генетических экспериментах было обнаружено, что в головном мозгу как контрольных (нативный контроль и принудительное плавание), так и обученных животных существует региональная специфичность в экспрессии генов Ascll и S100a6 . Обнаружено достоверное увеличение транскрипции гена Ascll в обеих экспериментальных группах (принудительное плавание) в гиппокампе (P<0,01) и префронтальной коре (P <0,01), а также мозжечке обученных крыс (P<0,01) по сравнению с нативными контрольными крысами. Оценка экспрессии гена Ascll в гиппокампе и мозжечке также выявила статистически достоверное повышение его активности в группе обученных животных по сравнению с активным контролем

(P<0,01). В гиппокампе увеличение экспрессии гена Ascl1 было в 5,2 раза и в 9,9 раза выше, соответственно в группах активного контроля и обученных крыс по сравнению с нативными крысами (P<0,01). В мозжечке обнаружено 5,0-кратное увеличение экспрессии гена Ascl1 у животных только в группе обучения по сравнению с нативным контролем, при этом, отличия от активного контроля не выявлено. В префронтальной коре не наблюдалось значительного снижения экспрессии гена Ascl1 во время формирования пространственной памяти (группа обученных животных) по сравнению с активным контролем. Активное принудительное плавание приводило к увеличению экспрессии гена Ascl1 в 7,2 раза в префронтальной коре, длительное обучение животных приводило к тому, что активность гена Ascl1 возрастала 5 раз по сравнению с нативными крысами. Паттерн экспрессии другого регулятора нейрогенеза - гена S100a6 был сходным в мозжечке и префронтальной коре, но не в гиппокампе. Таким образом, в группе обучения у животных уровень мРНК этого связывающего кальций/цинк белка был выше в мозжечке (Р<0,05) и префронтальной коре (Р<0,05), чем в активном контроле. У обученных крыс экспрессия гена ( S100a6 ) по сравнению с активным контролем была статистически выше в мозжечке (5,0 раза) и префронтальной коре (1,6 раза), но в гиппокампе она не была статистически изменена (P=0,29). По сравнению с наивным контролем различия в обеих экспериментальных группах (Р<0,05) были обнаружены только в префронтальной коре. В работе также были изучены корреляции между параметрами формирования пространственной памяти и внутри- и межструктурной экспрессией генов мозга экспериментальных животных. Корреляционный анализ проводился с целью изучения любых возможных взаимосвязей между параметрами формирования долговременной памяти и исследованной активностью транскрипционных генов. Обнаружены отрицательные корреляции между уровнем экспрессии S100a6 в гиппокампе и временем плавания, которые достигли статистически значимого уровня (P<0,05) на 3-м и 4-м днях экспериментов, в группе активного контроля. Это отличалось у принудительно плавающих крыс от первых двух дней экспериментов, где эти отрицательные корреляции были незначительными (P>0,05) .

В группе обученных крыс положительные корреляции были обнаружены только в префронтальной коре между уровнем экспрессии гена Ascl1 и средним временем до платформы в первый день тренировки. Установлены дополнительные положительные корреляции между экспрессией этого гена и средним временем платформы в 1-м исследовании на 3-м и 4-м учебных днях. Активные кон- трольные крысы отображали межструктурные связи между экспрессией гена S100a6 в префронтальной коре и гена Acsl1 в гиппокампе. Во время обучения, по сравнению с активным контролем, было показано, что существует более высокая статистическая корреляция между уровнем экспрессии всех изученных генов (Ascl1 и S100a6). У обученных крыс наблюдались положительные статистические корреляции во всех изученных структурах: в гиппокампе и префронтальной коре между экспрессией генов в мозжечке между генами S100a6 и Ascl1. В настоящем исследовании уровни экспрессии генов S100a6 и Ascl1 оценивались в гиппокампе, префронтальной коре и мозжечке на этапе поиска пространственной памяти по сравнению с нативными контрольными и активными пловцами.

Используя базу данных биоинформатики гена онтологии ( и базу данных об онтологии гена млекопитающих для взрослых генов (MANGO; , были проверены общие биологические процессы для продуктов гена Ascl1, т.е. нейронной дифференциации (GO: 0030182). В случае белкового продукта гена S100a6, который обозначен как S100-связывающий кальций белок A6-S100A6 или кальциклин, трансмембранный перенос ионов классифицируется отдельно в базе данных, то есть GO: 0034220. Следовательно, белок S100A6 представляет особый интерес для нейрональной функции за счет его участия в гомеостазе кальция [16].

Документировано, что влияние физической активности (активное плавание) и мягкого стресса на процесс нейрогенеза поддерживается дополнительно наблюдаемыми в настоящее время корреляциями между уровнем экспрессии гена S100a6 в гиппокампе и суммарным временем плавания активного контроля. В группе обученных животных корреляции с физиологическими показателями (время достижения платформы) были показаны только с экспрессией префронтального кортикального гена Ascl1 ,роль которого в нейрогенезе / апоптозе все еще неоднозначна. Ген Asc1l экспрессируется в нейрональных клетках - предшественниках в зубчатой извилине гиппокампа, но нет никаких доказательств того, что экспрессия Asc1l необходима для их генерации, выживания и развития. Однако сообщалось, что уровень экспрессии гена Ascl1 является одним из факторов, определяющих судьбу нервных клеток при активации нейротрофиновых рецепторов [17]. Изменения экспрессии Ascl1 в различных физиологических условиях остаются в значительной степени неизученными. Однако, было показано, что появление Ascl1-позитивных клеток-предшественников в зубчатой извилине гиппокампа у взрослых крыс может быть вызвано физической нагрузкой беговой дорожкой, протекающей в течение семи дней [18].

В наших экспериментах увеличение транскрипции белка Ascl1 было также обнаружено в гиппокампе и других структурах активного контроля по сравнению с наивными крысами, но корреляции с временем плавания не наблюдались. Вместе с этим, мы обнаружили снижение уровней транскрипции гена Ascl1 в префронтальной коре обученных животных на этапе становления пространственной памяти по сравнению с активным контролем. В связи с этим особый интерес представляют корреляции уровней мРНК Ascl1 в префронтальной коре с платформенным временем. Все анализируемые корреляции гена / времени плавания у обученных крыс были положительными, поэтому снижение экспрессии гена Ascl1 по сравнению с активными контрольными животными может быть связано с более быстрым приобретением навыка, поддерживаемым гиппокампом. По сути, гиппокамп опосредует формирование пространственной памяти, но след памяти в конечном итоге переносится в кору [19], что демонстрируют полученные результаты и это свидетельствует об этом постулате, потому что в этих двух структурах существует обратная связь в выражении экспрессии гена AScl1 . Было высказано предположение, что формирование памяти во время обучения основано на нейрогене-тических процессах, в которых роль Ascl1 играет значительную роль [20]. Повышенная концентрация мРНК Ascl1 в гиппокампе после 4 дней обучения может означать участие этого белка в регулятивных механизмах вышеуказанных процессов на всех этапах формирования пространственной памяти. В префронтальной коре мигрированная память, вероятно, инициирует подобные клеточные процессы на стадии активного плавания животных, а низкая выраженность экспрессии Ascl1 предвещает начальные этапы извлечения памяти в этой структуре, обосновывая ее структурную специфичность в формировании пространственной памяти. Было также постулировано, что белок Ascl1 играет значительную роль в развитии мозжечка [21].

В первый день обучения была обнаружена корреляция между экспрессией гена Ascl1 и временем достижения платформы (индикатор рабочей пространственной памяти). Однако в следующие дни обучения корреляции со временем достижения платформы были обнаружены только в первых попытках (3-й и 4-й дни обучения), что является наиболее важным критерием для долгосрочной пространственной памяти на этом конкретном этапе обучения. Следовательно, можно предположить, что существует определенная вовлеченность механизмов, связанных с изменением транскрипции гена Ascl1 в префронтальной коре, в процессы обуче- ния и формирование пространственной памяти и. Клетки-предшественники нейронов и олигодендроцитов во взрослом мозге экспрессируют ген AScl1 для содействия дифференциации/выживаемости клеток и противодействия гибели вновьобразован-ных клеток по типу апоптоза. В данном исследовании отмечается, что у обученных крыс в мозжечке и префронтальной коре одностороннее повышение экспрессии гена S100a6 происходит при формировании памяти по сравнению с принудительно плавающими животными. Этот одновременный импульс процессов выживания клеток происходит вместе с активацией экспрессии гена S100a6. Этот результат можно объяснить наличием внутри- и межструктурных связей обратной связи на генетическом уровне в активном контроле, что подтверждается обнаруженными корреляциями. Кроме того, уровень экспрессии Ascl1 и S100a6 в мозжечке во время обучения увеличились в пять раз по сравнению с активным контролем, и это может свидетельствовать о параллельной активации пролиферации /дифференцировки или координированных процессов нейропластичности. Мозжечок участвует в различных функциях, которые лежат вне его традиционной области сенсорно-моторного контроля. Тем не менее, было показано, что мозжечок является ключевой структурой в навигационной системе, а долговременная депрессия мозжечка при параллельных волокнах клеток Пуркенье, как правило, рассматривается как нейронный коррелятор мозгового моторного обучения [22].

Таким образом, одновременное исследование экспрессии двух генов, приводящее к генерации в отдельных функциональных областях мозга молекулярных факторов, вовлеченных в обеспечение процессов нейрогенеза, процессы которого лежат в основе формирования пространственной памяти, а также раскрывает специфические внутри - и межструктурные связи при обучении животных пространственному навыку в водном лабиринте. Результаты подтверждают роль гиппокампа в качестве основной структуры мозга при формировании долговременной пространственной памяти, а также интегративную связь гиппокампа с префронтальной корой и мозжечком. Эта структурная, генетическая и молекулярная комбинация важна для создания новых нейронных схем для консолидации и реконсолидации следов памяти с участием процессов нейрогенеза.