Использование аберрантно метилированных генов SEPT9 и ViM для клинической диагностики колоректального рака

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее агрессивных типов рака и занимает второе место по распространенности в России. Было доказано, что одна из основных причин, влияющих на развитие этого заболевания, – эпигенетические нарушения регуляции генов [1]. Определение эпигенетических нарушений имеет большое значение для ранней диагно- стики раковых заболеваний, так как нарушенная регуляция генов вследствие аберрантного метилирования ДНК является ключевой стадией в развитии опухоли [2]. При этом, метилированная ДНК является достаточно информативным биомаркером и может быть легко измерена в образцах крови или плазмы [3]. Метилирование обширных регионов CpG-островков

– основное эпигенетическое изменение, характерное для процессов канцерогенеза при КРР.

В настоящий момент на рынке представлены зарубежные коммерческие наборы для определения аберрантного метилирования генов SEPT9 либо VIM , однако эти наборы выпускаются разными фирмами и применение в диагностической практике сразу двух генов затруднительно.

Использование лишь одного маркера метилирования зачастую недостаточно для эффективной диагностики заболевания, так как показатели чувствительности и специфичности отдельных маркеров невысоки, поэтому представляет интерес проверка диагностических характеристик модели из нескольких маркеров. Для этих целей мы определяли частоту метилирования в генах SEPT9 и VIM.

Наличие аберрантного метилирования в гене SEPT9 тесно связано с развитием КРР. Даже на ранних стадиях КР отмечается гиперметилирование гена SEPT9 [1]. Септин принадлежит к классу ГТФ-связывающих полипептидов, которые задействованы в большом количестве клеточных процессов [4]. У людей в общей сложности 13 генов септина. Все септины могут образовывать гетеромерные комплексы и участвуют в формировании структур наподобие нитей, колец и клеток. Эти уникальные структуры участвуют в клеточном делении, формируют плазму мембраны, кольца сперматозоидов, основания ресничек и дендритов [5, 6].

Ген SEPT9 расположен на хромосоме 17q25.3, и экспрессируется в большинстве клеток человека. Было показано, что SEPT9 имеет 18 различных транскриптов, которые кодируют 15 полипептидов [7]. Они играют важную роль в динамике актина, в процессах ангиогенеза, в подвижности и пролиферации клеток, цитокинезе, регулировании микротрубочек, и процессах экзоци-тоза Несколько недавних исследований показывают, что SEPT9 занимает концевую позицию в октамерциссептиновом комплексе и играет ключевую роль в полимеризации субъединиц и стабилизации целых гетеромеров [8]. Это также имеет важное значение для окончательного разделения дочерних клеток во время цитокинеза.

Продукт гена VIM , виментин, входит в состав цитоскелета, а также задействован в иммунном ответе и контролирует транспорт липопротеинов низкой плотности. VIM содержит богатый CpG динулеотидами промотерный регион, рядом с которым расположен первый экзон, являющийся мишенью для ДНК-метилтрансфераз.

Было показано, что в 53-84% образцов опухоли и сыворотки больных КРР имеет место метилирование гена VIM [9, 10], таким образом, метилированный ген VIM является потенциальным маркером для диагностики КРР.

Важно отметить, что маркерные молекулы для диагностики заболеваний не всегда лежат в основе развития заболеваний. Данное утверждение в особенности справедливо для маркеров метилирования. В ряде работ было показано отсутствие прямой корреляции между аберрантным метилированием и выраженностью экспрессии генов [11, 12].

При анализе генома пациентов с КРР очень часто выявляются мутации (частота до 40%) [13]. KRAS является геном, кодирующим один из белков, играющих важную роль в сигнальной системе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) — сложного сигнального каскада, принимающего участие в развитии и прогрессировании рака. Белок KRAS регулирует другие белки, находящиеся далее в сигнальной системе EGFR, которые связаны с выживаемостью опухоли, ангиогенезом, пролиферацией и метастазированием [14].

При метастатическом колоректальном раке почти 60% пациентов имеют нормальную сигнальную систему EGFR и дикий тип гена KRAS ; остальные 40% имеют мутантный тип гена [13].

Тестирование генов, кодирующих белки семейства RAS (K-RAS и N-RAS) позволяет отобрать пациентов с диким типом (без мутации) генов RAS, у которых может быть получен ответ при лечении моноклональными антителами, блокирующими EGFR.

В данном исследовании мы обладали возможностью сопоставить статус мутации генов семейства RAS с наличием аберрантного метилирования в выбранных нами генах.

Основной задачей этой работы был анализ метилирования промотерных участков генов SEPT9 и VIM у пациентов с КРР для формирования единой панели эпигенетических маркеров, позволяющей диагностировать данную онкопатию с высокой чувствительностью и специфичностью.

Материалы и методы

Работа была одобрена локальным этическим комитетом, выполнена в соответствии с требованиями GCP (Good Clinical Practice) и Хельсинской декларацией по защите прав человека.

Исследование включало 150 парных образцов опухолевой ткани с известным статусом мутации генов семейства RAS и прилегающей гистологически неизмененной ткани пациен- тов с аденокарциномой прямой кишки, проходивших лечение в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Татарстан в 2008-2012 годах (таблица 1). Каждый пациент подписал добровольное информированное согласие на участие в проведении исследования. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза и описаны гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [12, 13]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов. Отбирали образцы из первичных очагов с содержанием опухолевых клеток не менее 50%.

Таблица 1

Клиническая характеристика пациентов

Пол	Количество
мужской	72
женский	78
Возраст
>50	124
<50	26
Стадия опухоли
Т2M0	11
Т3M0	36
Т4М0	38
Т2М1	2
Т3М1	18
Т4М1	28

Выделение ДНК осуществлялось набором QIAamp DNA FFPE Tissue Kit («Qiagen», Германия), концентрацию суммарной ДНК в водном растворе оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare», Великобритания) по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Бисульфитная конверсия и очистка проводились наборами EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit («Qiagen», Германия) с помощью автоматической станции пробо-подготовки QIAcube («Qiagen», Германия). Изучение профилей метилирования производилось с помощью метода MethyLight PCR c олигонуклеотидами (таблица 2), подобранными на локусы, содержащие дифференциально метилируемые CpG-островки, на приборе StepOnePlus™ RealTime PCR Systems («Applied Biosystems», США). В качестве неметилированного гена сравнения использовали COL2A1. Для определения степени метилирования вычисляли величину порогового цикла (Ct) для каждого гена-мишени, затем величину ∆CT (мишень-контроль), после значение ∆∆CT (мишень-калибрант). Величина RQ рассчитывалась по формуле RQ=2^(- ∆∆CT). Метилированным считался образец с RQ>10.

Статус мутаций в генах KRAS и NRAS определяли с помощью наборов KRAS-24 и NRAS-24 (ООО «Тестген», Россия).

Статистический анализ данных проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0.05. Конкор-дантность данных по метилированию оценивали с помощью непараметрической ранговой корреляции Спирмана. Значимость корреляции по Спирману (Rs) проверяли с помощью t-теста Стьюдента: с числом степеней свободы ν = N – 2, где N – размер выборки. Уровень значимости принят равным 10–6.

Чувствительность и специфичность маркеров оценивались с помощью ROC-анализа (MedCalc.2 software)

Результаты и обсуждение

В данном исследовании подтвердилось наличие аберрантного метилирования у пациентов, больных КРР. ДНК образцов опухоли была достоверно чаще метилирована, чем ДНК образцов прилежащей ткани (P=8,67E-19 для гена SEPT9 и P=8,68E-19 для гена VIM) (рис. 1). Довольно интересно, что гены SEPT9 и VIM не являются биологически значимыми маркерами в развитии КРР, однако ценность их как диагностических маркеров представляется нам очень высокой, так как в отличие от таких маркеров, как MLH1 и MGMT (продукты которых участвуют в канцерогенезе), они обладают высокими показателями как чувствительности, так и специфичности (чувствительность 60-70% для SEPT9 и VIM )

По результатам проведенной работы мы выявили, что в группе пациентов, имеющих мутации в генах KRAS или NRAS , ДНК опухолевых образцов достоверно чаще метилирована в генe SEPT9 ( P=0.0018 ), в отличие от ДНК опухолевых образцов пациентов, не несущих данных мутаций. В исследованиях похожей тематики также подтверждается частое гипермети-лированние промотерных участков генов при наличии активирующих мутаций гена KRAS [15]. Биологические основы этого обстоятельства на сегодняшний день до конца не изучены. Мы можем предположить, что процессы канцерогенеза у носителей мутаций в генах семейства

Таблица 2

Параметры праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени

Ген	Последовательность, 5’-3’	Длина продукта	Условия реакции, °С
SEPT9	Праймер - FM, TAGGGTTCGGGTTTCGTCG ,57C Праймер - RM,TTTCAAAACTTCGAAATCCG,51C Зонд - CGCGTTAACCGCGAAATCCG-BHQ1, 61C	98	51
VIM	Праймер - FM, GGCGGTTCGGGTATCG,56C Праймер - RM, CGTAATCACGTAACTCCGACT,54C Зонд - GACGCGGAGGCGAGTCGGTCG-BHQ1, 63C	146	54
COL2A1	Праймер - FM, AGGGTAATTTTGGAATAGATGGA, 64C Праймер - RM, TCTCCTAAAATAACAAAATCCACAA, 63C Зонд - CAACACTCACAACAAATCCTTTAACTCCAA –BHQ2, 69C	83	54

RAS протекают в целом быстрее и агрессивнее [16, 17], поэтому аберрантное метилирование в некоторых генах у пациентов-носителей мутаций также будет выражено сильнее.

Рис. 1. Процент метилированных образцов в зависимости от статуса мутации генов,кодирующих белки семейства RAS.

Мы провели корреляционный анализ для выявления зависимости степени прогрессирования КРР (учитывалось наличие или отсутствие метастазов) и частоты метилирования. Корреляция между данными показателями оказалась очень слабой (r=0,03967, P>0,05 для гена SEPT9 , r= 08871, P>0,05 для гена VIM ). Вероятно, для выявления степени прогрессирования КРР следует анализировать профиль метилирования.

На сегодняшний день для диагностики колоректального рака существуют наборы для определения метилирования в гене SEPT9 , либо набор для определения метилирования в гене VIM , однако обеспечить лишь одним из данных наборов необходимые для диагностики показатели чувствительности и специфичности представляется затруднительным. Использование нескольких маркеров позволили бы улучшить показатели диагностических тест-систем.

В рамках данной работы был рассчитан индекс метилирования для каждого образца и проверены параметры чувствительности и специфичности как для совокупности маркеров, так и для каждого маркера в отдельности. За пороговое значение для анализа совокупности маркеров был взят индекс метилирования, равный 0,5. Под индексом метилирования понимается отношение числа метилированных локусов к общему числу локусов модели. При этом значении система из маркеров имеет высокие показатели чувствительности и специфичности (91,3% и 78,0% соответственно). AUC, показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели, составляет 0,90, что говорит о высоком качестве модели.

Таким образом, использование нескольких маркеров при диагностике КРР позволяет существенно улучшить параметры тест-системы.

Выводы

В данной работе подтверждается высокая частота метилирования генов SEPT9 и VIM в опухолевых тканях больных КРР.

Для генов SEPT9 и VIM были установлены высокие показатели чувствительности и специфичности (чувствительность 70,7% и специфичность 89,4 % для SEPT9 , чувствительность 75,3% и специфичность 87,3% для VIM ), которые считаются важными клиническими маркерами, имеющими большие перспективы в диагностике КРР.

В настоящем исследовании мы показали, что

Рис. 2. Сравнение результатов ROC-анализа для каждого маркера в отдельности и для совокупности маркеров.

ДНК опухолевых образцов пациентов с мутациями в гене KRAS достоверно чаще метилирована в гене SEPT9 (P=0.0018) в отличие от ДНК опухолевых образцов пациентов, не несущих данных мутаций. Однако биологические основы этих результатов требуют дальнейших изучений.

Нами было продемонстрировано, что использование совокупности маркеров метилирования, таких как SEPT9 и VIM, позволяет улучшить чувствительность тест-систем, используемых в диагностике КРР, но показатели специфичности