Использование генов, кодирующих белки LTR, P24, GP51, POL в качестве ДНК-маркеров для индикации возбудителя лейкоза крупного рогатого скота в ПЦР-РВ

Инфекционные заболевания домашних животных оказывают существенное влияние на их продуктивность, жизнеспособность и рыночную ценность. Одним из таких заболеваний является лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы. Заболевание характеризуется патологически усиленной пролиферацией лимфоидных клеток в местах их возникновения и за их пределами, выбросом этих клеток в циркулирующую кровь, появлением злокачественных образований в кроветворных и других органах и тканях [1]. Подсчитано, что животные, инфицированные вирусом лейкоза, имеют молочную продуктивность на 12,7 % и содержание жира в молоке на 0,09 % ниже, чем серо-негативные [2].

Лейкоз крупного рогатого скота вызывается вирусом лейкоза крупного рога- того скота (ВЛ КРС), который является этиологическим агентом бычьего лейкоза и получил название «вирус лейкоза крупного рогатого скота» или Bovine Leukemia Virus (BLV). Он относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncoviridae. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) представляет собой B-лимфотропный онкогенный член семейства Retroviridae, который инфицирует крупный рогатый скот во всем мире и является возбудителем энзоотического лейкоза крупного рогатого скота (ЭЛ КРС), опухолевой пролиферации B-клеток [3, 4]. BLV-инфекция характеризуется длительным периодом вирусной латентности и отсутствием виремии. Считается, что это связано с репрессией транскрипции вирусной экспрессии in vivo [5]. Латентность, вероятно, является вирусной стратегией, позволяющей избежать иммунного ответа хозяина, тем самым способствуя развитию опухоли [6, 7]. Фактически, B-лимфоциты, несущие интегрированный провирус, не продуцируют определяемые уровни вирусной РНК или белков [8]. Тем не менее, когда эти клетки выделяют и культивируют in vitro, происходит заметное увеличение вирусной транскрипции, что свидетельствует о том, что провирус сохраняется на репрессированной стадии in vivo [9].

Что касается организации генома, то, как и у всех ретровирусов, BLV имеет структурные гены gag, pro, pol, env (от 5 до 3 генома), необходимые для продукции инфекционных вирионов [10]. В дополнение к этим генам геном ВЛ КРС содержит X-область, расположенную между геном env и 3-длинным концевым повтором (3-LTR) [11], как это также наблюдается в других дельтаретровирусах [12]. Этот регион содержит открытые рамки считывания четырех регуляторных белков: тран-сактиваторного белка tax [13], белка rex, который стабилизирует и позволяет экспортировать через цитоплазму вирусную РНК и два вспомогательных белка R3 и G4, чьи маленькие открытые рамки считывания расположены в области между геном env и генами tax или rex.

Для диагностики вирусных и бактериальных заболеваний методом ПЦР эффективного прохождения данной реакции, необходим тщательный подбор олигонук-леотидных затравок (праймеров, зондов), который, во-первых, зависит от нуклеотидной последовательности целевого гена, во-вторых, от химического состава праймеров, который влияет на образование вторичных структур (образования «шпилек» и димеров). Например, имеются сообщения о применении метода ПЦР для геноидентификации бактерии B.anthracis, штаммы которой способны вызвать бактериальное заболевание – сибирскую язву [14, 15].

В данной статье представлены результаты анализа эффективности прохождения ПЦР при использовании различных комбинаций праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов.

Целью представленной работы было повышение чувствительности и специфич- ности метода ПЦР для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Материал и методы исследований. Для проведения представленных в статье экспериментальных работ были отобраны 96 образцов цельной крови крупного рогатого скота, принадлежащего одному из сельхозпредприятий Лаишев-ского района РТ, неблагополучного по ВЛ КРС.

Из исследуемых образцов экстрагирована ДНК с использованием готового набора ДНК-сорб В (Ампли Прайм, Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию ДНК, выделенной из проб крови КРС, проводили на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, США) с использованием следующих комбинаций олигонуклеотид-ных затравок, специфичных к участкам генома возбудителя энзоотического лейкоза: первая комбинация комплементарна к участку гена gag, кодирующего нук-леокапсидный белок р24; вторая комбинация специфична к участку гена env, отвечающего за синтез поверхностного вирусного белка gp 51 ВЛ КРС; третья комбинация соответствует последовательности, кодирующей длинный концевой повтор LTR – LONG TERMINAL REPEAT; четвертая комбинация праймеров соответствует структурному гену pol, кодирующему полипептиды, обладающие ревер-тазной (РНК-зависимой ДНК – полимеразной) активностью.

Нуклеотидные последовательности комбинаций олигонуклеотидных затравок, представлены в таблице 1.

Объём вносимой ДНК – 8 мкл. Общий объём реакционной смеси 15 мкл. Программа ПЦР: 3 мин при 95°С; 45 циклов 15 сек при 95°С и 30 сек при 61°С или 60°С (в зависимости от температуры «отжига» праймеров). В качестве положительного контрольного образца (ПКО) использовали сборную пробу ДНК, выделенную из образцов крови коров, положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии.

В данной сборной пробе методом ПЦР определена высокая концентрация провирусной ДНК ВЛ КРС.

Таблица 1- Разработанные праймеры и флюоресцетно-меченые зонды

Название	Нуклеотидная последовательность 5'-3'	Расчетная температура отжига, °С
fp LTR	gagttagcggcaccagaagcgtt	60,6
rp LTR	cgcggtggtctcagccga	60,6
probe LTR	ROX- ccctcgtgctcagctctcggttctg-BHQ2	65
fp p24	ccgttaggctggtcatgtgggc	61
rp p24	ggcaccgggttcgcaagtatg	61
probe p24	ROX-tgatcgaccggggaagcaatatattggca- BHQ2	65
fp env3	tgttcaatgtttctcaaggcaacgc	60,5
rp env3	aggtgagtctctgatggctaagggc	60,5
probe env3	ROX-cctcctatctccctggttaatctctctacggc–RTQ2	60,5
fp pol	aacgcctccaggcccttcaa	60,3
rp pol	accgggaagactggattattgcct	60,3
probe pol	ROX-tctggaggcaggttatatctccccctgg-BHQ2	65
b kappa f	cttggcaggcacagtatttgaca	60,3-61
b kappa r	attactaccaacagaaaccagttgcac	60,3-61
b kappa p	CY5-ttgaagaatttgggcaggtgacctaactg-BHQ3	65

Помимо крупного рогатого скота по такому же алгоритму и с такими же олиго-нуклеотидными затравками исследовали образцы ДНК лошади, барана, свиньи, козла, крысы, мыши, кролика, штаммы (вакцинные) бруцеллеза и сибирской язвы. У лошади, барана, свиньи был изъят методом биопсии кусочек мышц; у крысы, кролика, мыши взяли кровь из сердечной мышцы; штаммы бруцеллеза и сибирской язвы были предоставлены лабораторией музея штаммов. В начале произвели гомогенизацию определенных исследуемых образцов: кусочки мышц лошади, барана, свиньи по отдельности растерли в фарфоровой ступке с помощью пестика, предварительно добавив физиологический раствор хлорида натрия 0,9 % до состояния однородной массы (суспензии). Из исследуемых образцов экстрагирована ДНК с использованием готового набора ДНК-сорб В (Ампли Прайм, Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию ДНК, выделенной из проб крови мыши, крысы, кролика; кусочков мышц лошади, барана, свиньи и козла; вакцинных штаммов бруцеллеза и сибирской язвы проводили на амплификаторе CFX 96 (BioRad, США) с использованием комбинаций олигонуклеотидных затравок, специфичных к участкам генома возбудителя энзоотического лейкоза – LTR, p24, gp 51, pol.

Результаты исследований. В результате проведенного исследования с ис- пользованием разработанных комбинаций праймеров к следующим ДНК-маркерам ВЛ КРС: gag, pol, LTR, env, установлено наличие провирусной ДНК в 58 исследуемых пробах крови КРС. Это исследование показало работоспособность данных комбинаций праймеров и зондов в ПЦР при индикации провирусной ДНК ВЛ КРС.

Также следует отметить, что при исследовании 32 проб наблюдалось совпадение результатов обнаружения провируса по всем четырём ДНК-маркерам (gag, pol, LTR и env). В 15 пробах наблюдали совпадение лишь по двум или трем маркерам. Были пробы, которые были положительными только по одному из представленных маркеров. Так образцы № 3, № 42, № 43 – по ДНК-маркеру gag (p24), по маркеру env – пробы № 24, № 37; по маркеру pol три пробы – № 1, № 33, № 48.

Полученные данные о несовпадении результатов обнаружения провируса по разным ДНК-маркерам подвели к следующему предположению, что возможно инфицированные лимфоциты могут содержать не только целиком всю провирус-ную ДНК, но и отдельные фрагменты генома вируса лейкоза крупного рогатого скота. Согласно сформулированной гипотезе, в одном лимфоците могут содержаться отдельные гены, кодирующие определенные белки ВЛ КРС (например, как в пробах № 1 – pol, № 3 – p24, № 24 – env, № 185 – LTR), гены, кодирующие два-три белка (как в пробах № 2 – p24, pol; № 10 – LTR, p24, pol; №13 – LTR, env), или гены, кодирующие все 4 основных белка ВЛ КРС (пробы № 5, № 6, № 9, № 14 – LTR, p24, gp 51, pol). Однако представленная гипотеза должна быть подтверждена более глубокими исследованиями, такими как полногеномное секвенирование генома инфицированных клонов лимфоцитов.

Также в ходе проведенных исследований были выявлены некоторые особенности разработанных комбинаций олигонуклеотидов. Так с помощью праймеров и зондов ДНК-маркера «LTR» (3 комбинация олигонуклеотидов) удалось определить наличие провирусной ДНК на более ранних циклах ПЦР по сравнению с другими комбинациями. Так разность значений Сt проб ДНК составила между 1 и 3 комбинациями 0,528 цикла, между 2 и 3

комбинациями – 1,296 цикла, между 3 и 4 комбинациями – 1,118 цикла (Таблица 2). Этот факт говорит о том, что за счёт использования комбинации праймеров к ДНК-маркеру «LTR» полимеразная цепная реакция будет иметь более высокую чувствительность при индикации провирус-ной ДНК возбудителя энзоотического лейкоза. Повышение чувствительности метода достигнуто за счёт уменьшения количества вторичных структур и димеров праймеров и зондов в процессе их дизайна, а также вследствие того, что маркерная последовательность LTR встречается дважды в начале и конце генома ВЛ КРС. Диагностика по четырем локусам увеличивает специфичность реакции и позволяет выявлять все известные типы и изоляты вируса, исключая возможность получения ложноотрицательных результатов.

Таблица 2 – Разность средних значений Ct между комбинациями олигонуклеотидов

Показатель	gag (p 24) (1 комб.)	env (gp 51) (2 комб.)	LTR (3 комб.)	pol (4 комб.)
Среднее значение	27,528	28,296	27,000	28,118
Разность средних значений Ct (1 комбинация)	0
Разность средних значений Ct (2 комбинация)	-0,768	0
Разность средних значений Ct(3 комбинация)	0,528	1,296	0
Разность средних значений Ct (4 комбинация)	-0,590	0,178	-1,118	0

В результате исследования образцов гетерогенной ДНК, полученной из биологического материала от лошади, барана, свиньи, козла, крысы, мыши, кролика, бактериальных культур вакцинных штаммов возбудителей бруцеллеза и сибирской язвы значение цикла (Ct) не определено, т.е. данные образцы ДНК в ПЦР с использованием специфичных праймеров для индикации провирусной ДНК ВЛ КРС не прореагировали. Это произошло по причине отсутствия сколько-нибудь идентичного нуклеотидного участка в исследованных образцах гетерогенной ДНК к целевым последовательностям, кодирующим белки LTR, P24, GP51, POL ВЛ КРС. Это исследование подтверждает результаты биоин- формацинного анализа последовательностей праймеров и зондов для индикации генома ВЛ КРС, представленных в таблице 1, с использованием онлайн-утилиты BLAST Национального Центра Биоинформатики (NCBI) [16], где было показано что анализируемым олигонуклеотидам ВЛ КРС не было найдено сколько-нибудь идентичных последовательностей других организмов. Результаты BLAST-анализа и экспериментальные данные подтверждают высокую специфичность разработанных олигонуклеотидов для индикации прови-русной ДНК ВЛ КРС.

Заключение. Использование различных ДНК-маркеров и комбинаций оли-гонуклеотидных затравок для амплифика- ции этих маркеров значительно влияет на чувствительность и специфичность ПЦР-РВ. Наиболее высокая чувствительность метода ПЦР при индикации провирусной ДНК ВЛКРС была достигнута при использовании ДНК-маркера, который кодирует LTR-концевой участок генома. Уникальность выбранных нуклеотидных последовательностей доказана в результате BLAST-анализа и путем проведения ПЦР с использованием разработанных праймеров к ДНК-маркерам, кодирующим белки LTR, P24, GP51, POL ВЛ КРС на гетерогенных образцах ДНК.

Резюме

Целью представленной работы было повышение чувствительности и специфичности метода ПЦР для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Для осуществления данной цели были разработаны и синтезированы комбинации праймеров и зондов, специфичные к генам ВЛ КРС, кодирующим капсидный белок p24, гликопротеин gp51, длинный концевой повтор LTR, структурный белок pol. Проведен анализ эффективности прохождения ПЦР при использовании разработанных комбинаций олигонуклеотидных затравок для ПЦР-РВ. В результате исследования установлено, что все разработанные комбинации праймеров и зондов позволяют с помощью метода ПЦР-РВ идентифицировать провирусную ДНК ВЛ КРС в образцах крови. Наиболее эффективными оказались праймеры и зонд к участку LTR генома вируса лейкоза КРС, при их использовании ПЦР стартует раньше по сравнению с другими использованными комбинациями олигонуклеотидов (p24, gp51, pol), что значительно повышает чувствительность метода. Данное исследование служит одним из этапов создания наиболее эффективной экспресс тест-системы для точного обнаружения возбудителя лейкоза в скотоводческих хозяйствах России.