Использование костного морфогенетического белка-2 для стимуляции остеорегенерации

В последние десятилетия в медицине для лечения травм и дефектов костной ткани наряду с трансплантацией все шире используются альтернативные методы, связанные с применением имплантатов на основе синтетических материалов – металлов, полимеров, керамики, цементов, стеклокристаллических и других композитов [1; 2; 6]. Процесс ассимиляции имплантата в организме сопровождается его частичным или полным растворением, проникновением в имплантат эндогенных протеинов, прорастанием кровеносных сосудов, ростом, размножением и делением клеток с образованием ткани, заполняющей поры имплантата и, наконец, ремоделированием вещества имплантата в натуральную кость [3; 4; 5].

Высокая потребность в остеоиндуктив-ных материалах стимулировала в медицине в последние 10–15 лет создание нового направления, основанного на применении морфогенетических белков кости (bone morphogenetic proteins, BMP-2, ВМР-3… - ВМР-15), входящих в суперсемейство ростовых факторов TGF-в [3]. BMPs содержатся в костях, хряще и некоторых других соединительных тканях, где они определяют интенсивность физиологического ремоделирования и регенерации [7]. Костный морфогенетический белок-2 является гликопротеином, который последовательно производит индукцию развития костей. BMP-2 оказывают плейотропную функцию, которая варьирует от внескелетного органогенеза к скелетному росту и регенерации. До настоящего времени не сложилось полного представления о регуляторных событиях при восстановлении костной ткани, однако ключевая роль ВМР-2 в управлении физиологической регенерацией кости уже не вызывает сомнений. Именно поэтому на основе ВМР-2 предпринимаются попытки создать остеоиндуктивные материалы нового поколения.

Цель работы – изучить в эксперименте возможность улучшения заживления костных дефектов за счет создания временных депо BMP-2 в области заживления.

Методика исследования

Исследование проводили на 16 лабораторных животных – самцах крысы линии Wistar 8месячного возраста массой 240–290 г. Под наркозом (Золетил в дозе 40 мг/кг массы внутрибрюшинно) из разреза кожных покровов до 5 мм по наружной поверхности нижней трети бедра животных путем прокола осуществляли чрезмышечный доступ к эпифизу бедренной кости. С помощью сверла диаметром 1,7 мм формировали канал на глубину 3,0 мм. В первой группе животных в канал пипеткой вводили 5 мг пасты, полученной из разведенного в 2 мл стерильного физиологического раствора порошка препарата «Gamalant™-паста-ФОР-ТЕ Плюс», содержащий BMP-2 производства в НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. В группе сравнения каналы наполняли биоинертным гелевым наполнителем. Через 3 и 6 недель эксперимента животных выводили из эксперимента передозировкой Золетила (200 мг/кг массы), для морфологического исследования забирали костный фрагмент в объеме нижней трети бедра.

Материал фиксировали в 10 % забуферен-ном нейтральном формалине в течение 24 часов, промывали 6 часов в проточной водопроводной воде комнатной температуры. Декальцинацию проводили в аналоге коммерческого препарата «Cal-Ex ®» (Fisher Scientific), который представлял собой водный раствор 1,35 N соляной кислоты и 0,003 М ЭДТА, полная декальцинация наступала через 15-20 часов [7]. Промывкой в проточной воде до нейтральной реакции промывочных вод добивались полной отмывки материала от декальцинирующей жидкости. После быстрой проводки материала по спиртам и полного обезвоживания, последний через ксилол заключали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5–7 мкм после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином, трехцветным методом по Массону, пикрофуксином по Ван–Гизону и заключали в канадский бальзам.

Готовые препараты анализировали с использованием микроскопа «БИМАМ-13» (ЛОМО, Россия) и цифровой камеры «FMA050» (ToupCam, Китай). Морфометрический анализ проводили с применением программного обеспечения «ImageJ» (США).

Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение маркеров мак-рофагов/остеокластов CD-68 и клеток остеогенного ряда – остеостеонектина (наборы Novocastra, Великобритания), подсчитывали численную плотность этих клеток в костной ткани. Для видео документирования и количественного морфологического анализа был использован компьютерный комплекс «Видео-тест-Морфо» 3.0 (Россия), программное обеспечение которого позволяло количественно определить градиенты численной плотности клеточных элементов в регенерате и оптической плотности матрикса. Их выражали как отношение между абсолютными показателями в глубокой и поверхностных зонах регене-рата/имплантата в безразмерных единицах.

Обработку количественных данных проводили непосредственно из общей матрицы данных Excel 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., USA) с учетом общепринятых требований для медико-биологических исследований. Для анализа различий между выборками использовали критерий Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

На месте дефекта кости к 3-й неделе в первой группе обнаруживался практически закрытый надкостницей смешанный регенерат. В поверхностных его слоях происходило образование рыхлой волокнистой соединительной ткани с большим количеством кровеносных сосудов. Глубже лежащие слои содержали островки хрящевой и костной тканей, окруженные соединительной тканью. В группе сравнения в те же сроки ткань представляла собой тонкие пучки коллагеновых волокон и плотно прилежащих друг к другу широких пучков, имеющих продольную ориентацию, многочисленных групп малодифференцированных клеток, большого количества сосудов капиллярного типа с минимальным присутствием истинных островков остеогенеза.

На 6-й неделе эксперимента в основной группе обнаруживали признаки интенсивного остеогенеза: формирующиеся на более ранних сроках очаги хрящевой ткани оcсифицировались и сливались с ранее образованными участками губчатой кости. Поверхность регенерата была покрыта надкостницей. В группе сравнения на месте закрытия дефекта остеопластической массой без факторов роста обнаруживали плотный смешанный регенерат с преобладанием костной ткани разной степени зрелости и довольно большими участками неоссифицированного хряща и соединительной ткани. Количество сосудов в глубоких слоях регенерата уменьшалось незначительно.

Весьма показательной была динамика градиента численной плотности клеточных элементов. При всей неоднородности и вариабельности распределения клеток в каждом отдельном регенерате, использование этого безразмерного показателя оказалось информативным. В основной группе на 3-й неделе остеогенные клетки были распределены в имплантате равномерно или с некоторым преобладанием в глубоких слоях, то к 6-й неделе их число в глубоких слоях четырехкратно превышало таковое в поверхностных. В группе сравнения градиент плотности остеоцитов к 6-йнеделе не превышал 2,5. При использовании BMP-2 градиент численной плотности остеокластов был значительно выше 1,0 уже к 3-й неделе, а к 6-й неделе был зафиксирован градиент более 6. В группе сравнения наблюдали более равномерное распределение остеокластов в регенерате при более высоких абсолютных значениях их численной плотности.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в условиях замещения дефектов костной ткани остеопластической массой, содержащей гидроксиапатит, коллаген и BMP-2, регенеративный процесс имеет лучшие количественные и качественные характеристики, в сравнении с пастой без факторов роста. Процесс ремоделирования в большей степени приближается к органотипичному восстановлению и практически завершается на тканевом уровне к 6-й неделе эксперимента. Полученные нами доказательства выраженного остеоиндуктивного эффекта BMP-2, позволяют использовать его в качестве компонента бесклеточных матриц при замещении области дефектов костной ткани.