Использование метода иммуногистоцитохимии при цитологических исследованиях

E-mail: sme@sibsme.ru

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ИММУНОГИСТОЦИТОХИМИИ ПРИ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

ОГУЗ «Новосибирское областное бюро судебномедицинской экспертизы»

Определение органо-тканевой принадлежности изолированных клеток по-прежнему является одной из актуальных проблем судебно-медицинской цитологии. Это связано с тем, что в состав любого органа входит несколько типов тканей, причем обычно только одна из них является специфической, клетки которой выполняют основную функцию данного органа, что приводит к их морфологической специализации, по которой можно судить об органном происхождении клеток. С другой стороны, клетки, происходящие из разных органов, но относящиеся к одному типу ткани, например, эпителиальной, имеют значительное сходство между собой [1]. Исходя из этого, представилось целесообразным провести сравнительный анализ возможностей дифференцирования эпителия различного органо-тканевого происхождения с привлечением новых методик.

Наше внимание привлекли методы иммуногистоцитохимии, которые соединяют принципы и методы химического анализа с принципами и методами морфологического изучения клеток и тканей, используемых в цитологии и гистологии. Благодаря этому обеспечиваются существенные преимущества в изучении морфофункциональной организации растительных и животных тканей, так как выявленное химическое вещество можно связать с определенной тканевой или клеточной структурой, т.е. установить его локализацию. Кроме того, иммуногистоцитохимические методы позволяют выявить точную локализацию того или иного тканевого или клеточного компонента – антигена с помощью иммунологических и гистологических реакций [2].

Основой для иммуногистоцитохимии является реакция антигена и антитела. Так, при постановке иммуногистоцитохимической реакции возможно определение рецепторов стероидных гормонов, например, рецепторов эстрогена и прогестерона. Оценка результатов реакций основана на избирательном окрашивании структур или выпадении окрашенного продукта в процессе реакции. Достижение качественного иммуноокрашивания должно сопровождаться отсутствием фонового окрашивания [3]. Иммуноцитохимические методики используются в настоящее время в онкоморфологии для морфологической 25

диагностики онкозаболеваний [4]. В последнее время появились данные о возможности применения иммуногистоцитохимического метода исследования (с использованием клеточных CD-маркеров) в судебно-медицинской практике для дифференциации Т- и В- лимфоцитов в зонах красной и белой пульпы селезенки с целью определения давности образования её повреждений [5].

Представилось целесообразным провести сравнительную оценку клеток буккального и вагинального эпителия от разных женщин фертильного возраста с достаточным эстрогенным фоном с использованием иммуноцитохимического метода.

Окраска препаратов проводилась по авидинбиотиновой методике. В качестве контроля использовалась группа мазков вагинального и буккального эпителия, окрашенных по стандартной методике: азур-эозином по Романовскому. Световая микроскопия осуществлялась в проходящем свете, на микроскопах фирм: «Carl ZEISS», объективы «Axiostar» и «Axiocum FL-40» (окуляр 15х, объективы 10х; 20х; 40х; 100х), объективы «Axiostar» и «Axiocum FL-40» с цифровыми видеокамерами [6].

При оценке полученных результатов было отмечено, что в мазках, окрашенных по стандартной методике: азур-эозином по Романовскому (контрольная группа препаратов), цитоплазма клеток как буккального, так и вагинального эпителия была бледноголубого или серо-голубого цвета. Ядра клеток имели четкие контуры и более интенсивную окраску, их хромогеновая субстанция имела вид мелкозернистой нежной сети. Половой хроматин в ряде клеток определялся в виде контурируемой точки, расположенной под оболочкой ядра.

При окраске клеток буккального и вагинального эпителия с использованием иммуноцитохимической методики окраска клеток буккального эпителия была сходна с окраской препаратов контрольной группы. Цитоплазма – бледно-голубого или серо-голубого цве- та; ядра окрашивались более интенсивно, определялась хромогеновая субстанция и половой хроматин (рис. 1).

При микроскопии препаратов, содержащих клетки вагинального эпителия, было отмечено, что цитоплазма ряда клеток, расположенных как группами, так и изолированно, окрашивалась в характерные коричневые оттенки. При этом интенсивность окраски варьировала: цитоплазма изолированных клеток, окрашивалась менее интенсивно в светло-коричневые или желто-коричневые цвета, чем клеток, расположенных группами. Окраска отдельных групп клеток была более интенсивной, преимущественно коричневого цвета. По нашему мнению, это явилось результатом механического наложения клеток друг на друга и суммацией эффекта окраски. Ядра клеток оставались голубого либо серо-голубого цвета, с сохранением хромогеновой субстанции и полового хроматина в ряде клеток. Фонового окрашивания, т.е. окрашивания внеклеточного пространства, не отмечалось. Дифференциальное окрашивание цитоплазмы клеток и ядер, по нашему мнению, свидетельствует о селективном специфическом окрашивании именно цитоплазматических структур клеток, которые и обладают в отличие от ядер гормонозависимой активностью (рис. 2).

Целью следующего этапа исследования было выявление зависимости окраски клеток буккального и вагинального эпителия от фаз овариально-менструального цикла. Исследовалась группа мазков буккального и вагинального эпителия, взятых в предовуляцион-ный, овуляционный и постовуляционный периоды цикла. Окраска препаратов проводилась также по авидин-биотиновой методике. При этом отмечено: окрашивание клеток буккального эпителия во всех трех группах мазков было одинаковым и сходным с окраской препаратов контрольной группы.

При микроскопии препаратов, содержащих клетки вагинального эпителия, наблюдалось следующее: наиболее интенсивное окрашивание препаратов отмечалось в предовуляционную и овуляционную фазы

Рис. 1. Клетки буккального эпителия. Окраска по авидинбиотиновой методике. Увеличение 400

Рис. 2. Клетки вагинального эпителия. Окраска по авидинбиотиновой методике. Увеличение 900

цикла. Причем разницы в окраске в этих двух группах нами не наблюдалось. Как и в проведенном ранее исследовании, цитоплазма изолированных клеток окрашивалась менее интенсивно в желто-коричневые цвета. Группы клеток были окрашены более интенсивно, преимущественно в светло-коричневые, коричневые цвета. Окраска мазков, взятых в постовуляционную фазу цикла, была несколько слабее. Отмечалось наличие пигмента светло-коричневого, желто-коричневого цвета, преимущественно в группах клеток. Наблюдалось также окрашивание и изолированных клеток, как правило, в серо-коричневые, серо-желтые цвета. Окраска ядер клеток не изменялась. Фонового окрашивания препаратов не отмечалось.

Таким образом, данное исследование с использованием иммуноцитохимического авидин-биотинового метода позволило провести дифференцирование эпителиальных клеток в зависимости от различного содержания в них рецепторов стероидных гормонов (эстрогена и прогестерона). Кроме того, проведенное исследование позволило выявить характерные изменения клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла.

Экспертная оценка данных иммуноцитохимического исследования клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах позволит повысить качество судебно-медицинских экспертиз и объективизировать выводы эксперта при определении органо-тканевой принадлежности клеток эпителиального происхождения.