Использование методов биотестирования и биоидентификации ксенобиотиков для оценки состояния водных экосистем

Существующая в настоящее время система контроля загрязнения водных объектов, основанная на определении химичес-кимианалитическимиметодамиотдельных токсических веществ, не обеспечивает сохранения экологического благополучия водных объектов. Это обусловлено рядом причин: отсутствием количественных аналитических методов определения всех токсических соединений, входящих в состав сточных вод, разнородным характером взаимодействия отдельных компонентов в смеси, вторично образуемыми соединениями, которые могут быть более токсичными, чем первоначальные.

Количество примесей в природных и сточных водах (тяжёлые металлы, пестициды, нефтепродукты и т.д.) достигает около миллиона наименований, а нормировано только около тысячи вредных веществ для водных объектов хозяйственно-питьевого и рыбохозяйственного пользования. В этих условиях особое значение приобретает применение интегральных методов оценки токсичности воды, к которым относится биотестирование – экспериментальное определение токсичности воды для гидробионтов, основанное на регистрации реакций тест-объектов [2; 6].

Биотестирование широко применяется для оценки качества природных вод, так как имеет ряд преимуществ перед гидрохимическими исследованиями, которые часто не позволяют определить неустойчивые в воде соединения или продукты трансформации токсикантов. Довольно обычны случаи, когда химический анализ не показывает наличия токсических веществ, в то время как биологическое тестирование выявляет острую токсичность воды для гидробионтов и наоборот, обнаруженные в пробах химические соединения не вызывают гибели и нарушения жиз- недеятельности тест-организмов, то есть не токсичны для них. Химический анализ часто требует сложной и дорогостоящей аппаратуры и применения предварительного концентрирования образцов. Биотестирование, давая интегральную оценку токсичности воды, может значительно сократить объём химико-аналитических работ и проводить контроль загрязнений водных объектов более оперативно [1].

Согласно современным представлениям, биотестирование – это оценка токсических эффектов действия химических веществ и их смесей по физиологическим, морфологическим реакциям, поведенческим изменениям, изменениям выживаемости, плодовитости тест-организмов в стандартных условиях Биотестирование с применением гидробионтов может быть использовано для оценки токсичности загрязняемых природных вод, контроля токсичности сточных вод, ускоренной оценки токсичности экстрактов, смывов и сред с санитарно-гигиеническими целями, для скрининга биологически активных веществ и фармакологических средств.

В соответствии с «Правилами охраны поверхностных вод», действующих в Российской Федерации с 1991 г., биотестирование является обязательным элементом системы контроля качества вод. Согласно этому документу, в общие требования к составу и свойствам воды водных объектов включены показатели токсичности (острое и хроническое токсическое действие), по которым нормируется качество воды.

Использование методов биотестирования для определения качества природных вод является достаточно сложной задачей, так как химический состав природной воды обычно неизвестен, а концентрации загрязняющих веществ довольно низки. Поэтому биотестирование природных вод

Cреда обитания

Terra Humana ¹ 1’2014

требует использования высокочувствительных тест-объектов. Метод должен обладать широкой разрешающей способностью, чтобы определять как острое, так и хроническое токсическое загрязнение, быть оперативным и удобным для проведения в полевых условиях. Кроме того, необходимо определение общей токсичности пробы, токсичности взвешенных веществ и токсичности фильтрованной или отстоянной воды, поскольку распределение токсикантов в экосистеме возможно в воде, донных отложениях и взвешенных веществах.

В настоящее время основным руководящим документом, согласно которому производится биотестирование природных вод в РФ является [3], где в качестве тест-объектов рекомендуются рыбы, водоросли и ракообразные (дафнии и цериодафнии). Из ракообразных в качестве тест-объектов наибольшее распространение получили ветвистоусые рачки Daphnia magna . Эти гидробионты являются фильтраторами и пропускают через свой организм большое количество водной среды, что обусловливает их высокую чувствительность к растворенным в воде веществам. Дафнии повсеместно используются при оценке санитарногигиенического состояния вод, при установлении ПДК веществ – загрязнителей.

Метод биотестирования с использованием ветвистоусых рачков Daphnia magna является одним из наиболее широко применяемых в водной токсикологии. Это обусловлено тем, что дафнии широко распространены в природе, легко культивируются в лабораторных условиях, обладают высокой чувствительностью ко многим классам токсикантов [7].

Биотестирование с использованием в качестве тест-объекта Daphnia magna во многих странах Европы (в том числе и в России) и США является одним из обязательных методов исследования в системе контроля качества воды [4].

Химический анализ часто требует дорогостоящей аппаратуры, предварительного концентрирования изучаемых соединений и практически невозможен в полевых условиях. Биологическое тестирование, давая интегральную оценку токсичности воды, может значительно сократить объём химико-аналитических исследований, существенно снизить материальные затраты на мониторинг и проводить контроль загрязнений водных объектов более оперативно.

Однако несмотря на все свои преимущества, метод биотестирования имеет и существенный недостаток – он позволяет оценить только общую токсичность исследуемых образцов воды, природа же токсикантов остаётся неизвестной. В лаборатории гидрохимии и водной экотоксикологии Института озероведения РАН разрабатывались нетрадиционные методы биоидентификации ксенобиотиков, опасных для водной среды, с использованием в качестве тест-объектов дафний на основе изучения механизмов токсического действия различных загрязнителей [5; 8]. Зная механизмы специфического токсического действия, можно с помощью различных фармакологических средств ослабить или усилить эффекты токсикантов. Вышесказанное широко применяется при использовании в качестве тест-объекта

Таблица 1

влияние холиноблокаторов на токсичность фоС (Диизопропилфторфосфат) и карбаматов (Ами-ностигмин) в опытах на дафниях

Холинобло-каторы (мг/л)	лк50 (мг/л) дии-зопропилфтор-фосфата	кЗ	лк50 (мг/л) Аминостиг- мина	кЗ
Контроль	0,00021+0,00005	–	0,012+0,002	–
Атропин 6,0	0,00073+0,00006*	3,5	0,042+0,009*	3,5
Глипин 2,0	0,00074+0,00001*	3,5	0,069+0,019*	5,7
Педифен 1,0	0,00063+0,00008*	3,0	0,024+0,002*	2,0

Таблица 2

влияние антагонистов на токсичность хлорор-ганических соединений (ДДт) и пиретроидов (циперметрин) в опытах на дафниях

Препараты (мг/л)	лк50 ДДт (мг/л)	кЗ	лк50 ципер-метрина (мг/л)	кЗ
Контроль	0,08+0,02	–	0,057+0,003	–
Фенобарбитал 1,0	0,23+0,07*	2,9	–	–
Феназепам 0,1	0,32+0,09*	4,0	–	–
Кетамин 0,1	–	–	0,62+0,17*	10,9
Нипагин 0,1	–	–	0,29+0,03*	7,9

Таблица 3 влияние комплексообразователей на токсичность солей свинца и ртути в экспериментах на дафниях

комплексообра-зователи (мг/л)	лк50 (мг/л) Ртуть	кЗ	лк50 (мг/л) Свинец	кЗ
Контроль	0,16+0,06	–	1,70+0,62	–
ЭДТА 10,0	3,20+0,06*	20,0	6,60+1,48*	3,9
Унитиол 100,0	1,69+0,28*	10,6	13,45+2,24*	7,9

Примечание: * – все результаты опытов, приведённые в таблицах 1,2 и 3 достоверно отличаются от контрольных при сравнении по критерию t Стъюдента (Р<0.05).

лабораторных животных (мышей, крыс и др.), но совершенно не было разработано для альтернативных биообъектов, в частности гидробионтов, которые обладают чрезвычайно высокой чувствительностью ко многим загрязнителям. Использование такого подхода позволяет с помощью биообъекта проводить идентификацию некоторых ксенобиотиков, последствия отравления которыми можно предотвратить с помощью антагонистов (антидотов).

Среди множества поллютантов, попадающих в водную среду, особую опасность представляют фосфор- и хлорорганичес-кие соединения, карбаматы, пиретроиды, тяжёлые металлы, отличающиеся высокой токсичностью, способностью к биоконцентрированию и избирательностью действия. Многие соединения этих классов находят широкое применение в промышленности, сельском хозяйстве, медицине, оборонных отраслях, а тяжелые металлы могут поступать в водоёмы естественным путём из близлежащих месторождений.

Настоящее исследование предпринято с целью разработки новых методов биоидентификации в воде фосфор- и хлорорганичес-ких соединений, карбаматов, пестицидов из класса пиретроидов и тяжёлых металлов с применением в качестве тест-объекта Daphnia magna . Поскольку биохимическими мишенями токсического действия этих ксенобиотиков являются различные рецепторы нервной системы, в ходе настоящего исследования были изучены холинергическая, дофамин-, глютамат-ергическая, а также ГАМК-ергическая (гаммааминомасляной кислоты) медиаторные системы дафний.

С целью разработки новых методов биоидентификации ксенобиотиков в опытах на дафниях была определена токсичность ряда фосфорорганических соединений (ФОС) и карбаматов, хлорорганических соединений, пиретроидов, а также солей тяжёлых металлов. Изучение механизмов токсического действия данных ксенобиотиков в опытах на дафниях с использованием биохимических и фармакологических методов исследования показало, что ФОС и карбаматы взаимодействуют с холинергической системой дафний и ингибируют активность фермента холинэстеразы. Блокаторы холинергических рецепторов (атропин, глипин, педифен и др.) существенно снижали токсичность ФОС и карбаматов и предотвращали гибель дафний при отравлении несколькими среднелетальными концентрациями (ЛК50) этих ксенобиотиков, о чём свидетельствуют коэффициенты защиты (КЗ), представляющие собой отношение среднелетальных концентраций токсикантов в опыте к контролю (табл. 1).

Установлено, что токсическое действие хлорорганических соединений обусловлено блокадой ГАМК-ергической системы дафний. Ряд противосудорожных препаратов (диазепам, феназепам, барбитураты) повышали толерантность гидробионтов к хлорорганическим соединениям (табл. 2).

Изучение механизма токсического дейс- твия пиретроидов показало, что эти соединения взаимодействуют с глутаматными, дофаминергическими рецепторами и кальциевыми каналами нервной системы дафний. Антагонисты этих рецепторов (кетамин, галоперидол и нипагин) нивелировали токсическое действие пиретроидов (табл. 2).

Для биоидентификации солей тяжёлых металлов была использована способность комплексонов (ЭДТА, унитиол, тиосульфат натрия, гуминовые кислоты) образовывать с металлами либо нетоксические соединения, либо плохо растворимые в воде комплексы, что препятствует поступлению токсикантов в организм гидробионта. Применение комплексообразователей позволяло в несколько раз снизить токсичность тяжёлых металлов для дафний, причём наиболее эффективны комплексоны были в отношении наиболее токсичных – ртути, свинца, меди и кобальта (табл. 3).

Знание механизмов токсического действия ксенобиотиков и использование спе- цифических антагонистов (антидотов) позволило разработать чувствительные методы экспресс-биоидентификации различных классов токсических соединений и ввести их в практику экотоксикологи-ческого мониторинга.

В течение последних десяти лет в лаборатории гидрохимии и водной экотоксикологии ИНОЗ РАН определялось качество воды Ладожского озера методами биотестирования и биоидентификации. Острую токсичность проб определяли по стандартной методике в соответствии с методическим руководством по биотестированию воды (РД 118-02-90). В качестве контроля использовалась отстоянная дехлорированная вода, стандартно применяемая для содержания культуры дафний в лабораторных условиях. Наблюдение велось в течение 96 часов. Критерием острой токсичности являлась гибель 50% и более дафний по сравнению с контролем. Биотестирование нетоксичных образцов после этого прекращалось. Пробы, проявившие острую токсичность, подвергались последовательному разбавлению в 2; 4; 8 и т.д. раз водой, используемой в качестве контроля, после чего процедура биотестирования повторялась при каждом разбавлении.

На следующем этапе, с целью определения в токсичных пробах солей тяжёлых ме-

Cреда обитания

таллов, фосфорорганических и хлороргани-ческих соединений и пестицидов из класса пиретроидов в пробы воды вводились их специфические антагонисты и биотестирование повторялось в их присутствии. В качестве индикаторного вещества для определения тяжелых металлов использовали комплексообразователь унитиол, для фосфорорганических веществ – холинолитик атропин, для пиретроидов – блокатор кальциевых каналов нипагин и для хлорорга-нических соединений – препарат из группы бенздиазепинов диазепам. Указанные препараты вводились в пробы в концентрациях, равных 1/10 их средних летальных концентраций для дафний. Критерием наличия в пробах того или иного класса токсикантов служило снижение гибели дафний меньше 50% в присутствии соответствующего индикаторного соединения по сравнению с пробами без него.

Данные изучения токсичности вод Ладожского озера за последние 10 лет отличаются стабильностью. Подавляющее большинство изученных проб либо вообще не вызывали гибели дафний, либо в пробах погибало от 10 до 40% гидробионтов, что свидетельствует об отсутствии токсичности в данных образцах воды. Из всех изученных образцов острой токсичностью обладали пробы со станций в Волховской губе, в которых гибель дафний колебалась от 50 до 80% в течение всего периода наблюдения. Также, токсичными были пробы из р. Невы в октябре 2010 г. (70% гибели), при этом в мае и июле вода с данной станции не была токсичной для дафний.

Разбавление токсичных образцов отстоянной водопроводной водой в 2 раза привело к резкому снижению токсичности в пробах со станций в Волховской губе и из Невы (гибель тест-объектов составляла 20; 0 и 10% соответственно).

На следующем этапе было проведено биотестирование токсичных образцов воды в присутствии унитиола, атропина, диазепама и нипагина с целью биоидентификации тяжелых металлов, фосфорорга- нических и хлорорганических пестицидов и пиретроидов.

Атропин, диазепам и нипагин практически не оказывали никакого влияния на выживаемость дафний во всех изученных пробах воды, что свидетельствует об отсутствии в них фосфорорганических, хлорорганичес-ких соединений и пиретроидов. В пробах из Невы выживаемость дафний не изменял и унитиол, что свидетельствует об отсутствии в данных образцах солей металлов.

В то же время, все токсичные пробы воды из Волховской губы реагировали на добавление унитиола резким снижением гибели дафний (до 0–20%), что показывает наличие в них солей металлов в токсических концентрациях.

Представленные данные свидетельствуют о стабильной токсичности вод Волховской губы, где пробы с двух станций ежегодно вызывают гибель не менее 50% дафний при биотестировании. Причиной высокой токсичности по данным биоидентификации с высокой степенью вероятности является наличие в воде растворенных солей металлов. Дважды за период исследования (в сентябре 2008 и в августе 2009 г.) отмечалась острая токсичность воды в бухте Петрокрепость и один раз (ноябрь 2010) – в р. Неве. Учитывая, что обе станции находятся в районе интенсивного судоходства, можно предположить, что временное повышение токсичности было вызвано попаданием в воды озера токсикантов (топливо, смазочные материалы и т.п.) с проходящих судов. За 3 последних года было проведено изучение токсичности более 100 проб воды из центральных глубоководных районов озера. Эти результаты позволяют полагать, что данные районы озера являются наиболее благополучными в токсикологическом отношении.

Таким образом, применение в системе оценки качества вод методов биоидентификации ксенобиотиков позволяет не только дать интегральную оценку токсичности, но и выявить некоторые классы химических соединений, ответственные за загрязнение исследуемой воды.