Использование микросателлитного анализа для выявления биотипов у сортов ярового рапса (Brassica napus L.)

Введение. Рапс ( Вrassica napus L. ) – одна из перспективных масличных культур для обеспечения населения растительным маслом и животноводства кормовым белком [1]. Основными направлениями селекции рапса являются: улучшение количественных характеристик растений, улучшение качественных свойств сортов, создание сортов с улучшенными биотическими и абиотическими признаками. Для создания сортов рапса с комплексом вышеназванных признаков проводится непрерывная работа по созданию соответствующего исходного материала. С применением простых, двойных, ступенчатых схем внутривидовых скрещиваний с последующим индивидуальным отбором и инбридингом создан разнообразный исходный материал для селекции яровых форм рапса [2].

Наряду с традиционной селекцией в последнее время стала широко применяться селекция, основанная на применении молекулярных ДНК-маркеров, так называемая маркер-вспомогательная се- лекция (Marker-assisted selection – MAS). Преимущество этой селекции заключается в адекватности генетической оценки исходного материала, что приводит к точности отбора, даже если селективная аллель является рецессивной, а растения гетерозиготны. Это приводит к сокращению числа циклов или даже этапов селекционной программы и реальному ускорению селекционного процесса на несколько лет. Также возможно проведение оценки отбора на ранних стадиях роста и развития растений – вплоть до 5– 7-дневных проростков, что дает возможность выбраковывать неперспективный материал и экономить финансовые и материальные ресурсы [3]. Молекулярные маркеры позволяют надежно различать виды, подвиды, сорта и инбредные линии растений и даже близкородственные формы [4]. Для идентификации необходимо иметь каталоги и базы данных «генетических паспортов», охватывающие генетическое разнообразие культуры или вида в целом, в т.ч. всех сортов и гибридов [5].

Также для подбора родительских пар при скрещивании, контроля гибридности наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма микросателлит-ных последовательностей ( Simple Sequence Repeats – SSR ), позволяющий получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа – его ДНК-профиль. В предыдущих работах нами была показана возможность паспортизации сортов рапса [6]. Однако паспортизировать удалось только линейные сорта рапса, в основном зарубежной селекции, при этом наши сорта оказались популяциями, т.е. состоящими из нескольких генотипов. Тогда было сделано предположение, что эти сорта можно разделить на биотипы, по аналогии с другими культурами, такими как рожь [7].

Таким образом, цель данной работы заключалась в оценке степени генетической однородности сортов ярового рапса методом микросателлитного анализа, вычислении частоты встречаемости аллелей, а также разделении на отдельные биотипы с последующим их сравнением с ис- ходными сортами по хозяйственно ценным признакам.

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили два сорта ярового рапса селекции ВНИИ рапса: Булат и Форвард.

Сорт Булат 00 типа включен в Госре-естр по Северо-Западному и ЦентральноЧерноземному регионам. Средняя урожайность семян в Северо-Западном регионе 11,0 ц/га, в Центрально-Черноземном регионе – 12,2 ц/га, наибольшая – 25,2 ц/га (Курская область). Вегетационный период 92 дня. Устойчивость к полеганию 4,7–5,0 балла, к осыпанию – 3,9– 4,3 балла. Высота растений 101,2 см, масса 1000 семян – 3,2–3,7 г. Содержание жира в семенах 42,5–44,0 %. Рекомендован для возделывания на семена и корм.

Сорт Форвард 00 типа включен в Гос-реестр по Северо-Западному, Центральному, Центрально-Черноземному, Средневолжскому, Уральскому и ЗападноСибирскому регионам. В СевероЗападном регионе наибольшая урожайность получена в Калининградской области – 30,9 ц/га. Вегетационный период 86 дней. В Центральном регионе в Рязанской и Тульской областях средняя урожайность составила 27,0 и 33,8 ц/га соответственно. Вегетационный период 86 дней. В ЦЧО, в Курской области, средняя урожайность была 18,2 ц/га, вегетационный период – на 5 дней короче, чем у стандарта. Масличность 45,0 %, что выше чем у стандарта на 3,8 %. В Средневолжском регионе наибольшая урожайность получена в Республике Татарстан – 21,2 ц/га, масличность – 41,6 %, что выше стандарта на 4,1 %. Вегетационный период 90 дней. В Уральском регионе наибольшая урожайность получена в Челябинской области – 27,3 ц/га. Вегетационный период 97 дней. В ЗападноСибирском регионе наибольшая урожайность составила 38,7 ц/га (в Томской области), прибавка 10 %. Вегетационный период 102 дня, масличность – 50,0 %, что выше чем у стандарта на 2,4 %. Рекомендован для возделывания на семена.

Геномную ДНК выделяли из первых настоящих листьев модифицированным СТАВ-методом [8]. Полимеразную цепную реакцию осуществляли с помощью локус-специфичных пар праймеров [9]. Реакции проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20–50 нг ДНК, по 10 пмоль каждого из праймеров (один из праймеров был помечен флуоресцентным красителем Cy5), буферный раствор, содержащий 100 мМ tris-HCl (pH 8.3), 25 мМ MgCl 2 , 500 мМ KCl, 400 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед. акт. ДНК-полимеразы "ThermoStar". Активация термостабильной ДНК-полимеразы происходила в результате экспозиции реакционной смеси при 95 ^оС в течение 10 мин перед проведением ПЦР. Амплификация осуществлялась при следующих температурных условиях: 1 цикл: 95 ^оС – 10 мин, 30 циклов: 94 ^оС – 30 сек, T отж – 30 сек, 72 ^оС – 30 сек; 1 цикл: 72 ^оС – 5 мин. Для амплификации использовали термоциклер «Терцик» фирмы «ДНК-технология» (Россия). Анализ флуоресцентно-меченых ПЦР-фрагментов проводили методом электрофореза в денатурирующих условиях с помощью автоматического анализатора ALFexpress II Amersham BioSciences (США). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ ALFwin Software Fragment Analyzer (США). В работе использовалось оборудование центра коллективного пользования научным оборудованием ВНИИСБ «Биотехнология».

Жирно-кислотный состав масла определялся в лаборатории химических анализов ВНИИ рапса по методике [10] методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ 30089-93 [11].

Результаты и обсуждение. На первом этапе исследований для исследуемых сортов определяли степень их генетической однородности. На рисунке 1 представлены результаты анализа генетической однородности сорта Булат по трем парам праймеров: Bna.M.001, Bna.M.006, Bna.M.005. В результате анализа сорта Булат по исследуемым парам праймеров выявлено несколько вариантов генотипов с разным аллельным составом, что свидетельствует о его генетической неоднородности (рис. 1). По сорту Форвард была получена аналогичная картина. Таким образом, можно предположить, что данные сорта являются сортовыми популяциями, состоящими из нескольких генотипов.

Рисунок 1 – Электрофореграмма разделения в 8 %-ном ПААГ продуктов ПЦР сорта Булат, полученных по трём парам праймеров: А – Bna.M.001, B – Bna.M.006, C – Bna.M.005. 1, 2, 3 – аллели; I, II, III – генотипы. По паре праймеров Bna.M.006:

I генотип – дорожка 30, II генотип – дорожка 8, III генотип – дорожка 12

Дальнейшие исследования по созданию ДНК-паспорта сорта проведены нами по схеме, взятой из литературных источников [12], состоящей из следующих этапов: 1 – оценка однородности; 2 – в случае гетерогенности материала оценка частоты встречаемости аллелей и дифференциация образца на биотипы, т.е. группы растений с различным аллельным составом; 3 – анализ ДНК одного образца каждого биотипа по остальным ранее отобранным локусам, 4 – запись данных в виде молекулярно-генетической формулы.

На основе предложенной схемы в первую очередь была проведена оценка частоты встречаемости аллелей микросател-литных локусов и генотипов обоих сортов (рис. 2 и 3). В итоге были получены данные по соотношению и преобладанию определенных аллелей по каждому из исследуемых сортов.

Рисунок 2 – Частота встречаемости аллелей по трём парам праймеров: Bna.M.001, Bna.M.006, Bna.M.005.

1, 3, 5 – сорт Булат; 2, 4, 6 – сорт Форвард. Расположение аллелей см. на рис. 1

Рисунок 3 – Частота встречаемости генотипов по трём парам праймеров:

Bna.M.001, Bna.M.006, Bna.M.005.

1, 3, 5 – сорт Булат; 2,4,6 – сорт Форвард.

Расположение генотипов см. на рис. 1.

На основании этого, согласно предложенной в работе [12] принципиальной схеме, были выделены отдельные биотипы по каждому сорту. По сорту Булат было выявлено пять биотипов с частотой встречаемости аллелей более 5 %: I биотип с частотой встречаемости аллелей 37,5 %, II биотип – 12,5 %, III биотип – 10 %, IV и V биотипы – по 7,5 % (рис. 4). Затем из каждого биотипа сортов Булат и Форвард мы отобрали по три растения, которые обозначили: 411–413 – 1-й биотип сорта Форвард, 421–423 – 2-й биотип, 431–433 – 3-й биотип, 441–443 – 4-й биотип, 451-453 – 5-й биотип сорта Форвард;

511–513 – 1-й биотип сорта Булат, 521–523 – 2-й биотип, 531–533 – 3-й биотип, 541– 543 – 4-й биотип, 551–553 – 5-й биотип сорта Булат. Отобранные растения также были проверены по трём вышеуказанным парам праймеров на наличие генетической однородности (рис. 5).

Рисунок 4 – Электрофореграмма разделения в 8 %-ном ПААГ продуктов ПЦР сорта Булат, полученных по трём парам праймеров: А – Bna.M.001, B – Bna.M.006, C – Bna.M.005. I – 37,5 %; II – 12,5 %;

III – 10 %; IV – 7,5 %; V – 7,5 %; VI ≤ 5 % (примесь)

Рисунок 5 – Электрофореграмма разделения в 8 %-ном ПААГ продуктов ПЦР сортов Форвард и Булат, полученных по трём парам праймеров : А – Bna.M.005, B – Bna.M.006, C – Bna.M.001. 411–413 – 1-й биотип сорта Форвард, 421–423 – 2-й биотип, 431–433 – 3-й биотип, 441–443 – 4-й биотип, 451–453 – 5-й биотип сорта Форвард;

511–513 – 1-й биотип сорта Булат, 521–523 – 2-й биотип, 531–533 – 3-й биотип, 541–543 – 4-й биотип, 551–553 – 5-й биотип сорта Булат

Далее для посева взяли по одному растению из каждого биотипа, а также в ка- честве контроля наши исходные сорта-популяции – Форвард и Булат: 4–14 – исходный сорт Форвард, 412–14 – 1-й биотип сорта Форвард, 423–14 – 2-й биотип, 433 – 3-й биотип, 442–14 – 4-й биотип, 453–14 – 5-й биотип сорта Форвард; 5–14 – исходный сорт Булат, 511–13 – 1-й биотип сорта Булат, 523 – 2-й биотип, 533 – 3-й биотип, 543 – 4-й биотип, 552 – 5-й биотип сорта Булат (таблица). Выращивание растений производили в условиях полевого опыта. Во время цветения на все растения были надеты изоляторы для предотвращения их перекрестного опыления. Уборку проводили вручную, семена с каждого растения обмолачивались в отдельный пакет, который подписывали.

Таблица

Содержание олеиновой кислоты в образцах ярового рапса

Сорт, биотип сорта	Содержание олеиновой кислоты, %	Отклонение от стандарта, %
Форвард, контроль	58,35	-
1 биотип – 412-14	62,66	4,31**
2 биотип – 423-14	61,955	3,605*
3 биотип – 433-14	60,433	2,08
4 биотип – 442-14	61,3	2,95*
5 биотип – 453-14	60,583	2,233
НСР 05 =2,68, НСР 01 =3,618
Булат, контроль	59,71	-
1 биотип – 511-13	68,83	9,12**
2 биотип – 523-14	58,97	-0,74
3 биотип – 533-14	65,98	6,27**
4 биотип – 543-14	67,92	8,21**
5 биотип – 552-14	64,53	4,82**
НСР 05 =2,16, НСР 01 =3,024

*достоверность различий на 5 %-ном уровне значимости,

**достоверность различий на

1 %-ном уровне значимости

Дальнейшая характеристика полученных биотипов по каждому сорту заключалась в проведении биохимического анализа их семян по жирно-кислотному составу и сравнении с показателями исходных сортов. В результате были получены данные по процентному содержанию основных жирных кислот семян (пальмитиновой, олеиновой, линолевой, линоленовой, эйкозеновой и эруковой) биотипов и исходных сортов. Известно, что основным требованием, предъявляемым к современным сортам, принимаемым в производство пищевого рапсового масла, является содержание менее 0,6 % глюкозинолатов в семенах и снижение практически до нуля эруковой кислоты в масле. Олеиновая кислота является моно-ненасыщенной жирной кислотой, относящейся к группе омега-9, без которой невозможен правильный обмен веществ. В таблице приведены данные по содержанию олеиновой кислоты в сравниваемых биотипах относительно соответствующих им исходных сортов.

В результате установлено, что все исследуемые биотипы превосходят исходные сорта по содержанию олеиновой кислоты в среднем на 3–9 %, что дает возможность для их использования в дальнейшей работе.

Известно, что биотипы представляют собой группы растений с различным аллельным составом [12]. Биотипный состав напрямую связан с урожайностью через вклад разнокачественных по адаптивной ценности биотипов. Именно с этих позиций работают селекционеры, вовлекая в систему скрещиваний сорта различных экологических групп, используя системы сортосмесей, предусматривающие объединение компонентов, неравнозначных по адаптивным свойствам.

Ранее в ряде своих работ исследователи осуществляли направленный селекционный процесс ряда культурных растений через выделение и анализ биотипов. Так, использование в селекции многокомпонентных сортов с различающимися по адаптивности компонентами позволяет поддерживать уровень продуктивности на относительно стабильном уровне, причем такой эффект достигается за счет наличия в таких сортах генотипов, различающихся по реакции на условия среды и обеспечивающих выраженный компенсаторный эффект [13]. Бороевич С.В. указывает, что в сорте находятся биотипы, устойчивые к лимитирующим факторам отдельного го- да, или к определенной местности. Он считает, что через биотипы реализуется явление взаимодополняемости составных компонентов сорта за счет того, что пониженный уровень в проявлении признака продуктивности по одному компоненту компенсируется достаточно высоким уровнем признака для другого компонента или результатом их совместного эффекта на конечный результат в популяции [14]. Результатами данного анализа подтверждается факт неравнозначности биотипов по обеспечению суммарной продуктивности озимой пшеницы. Особенно это касается уровня главного биотипа, т.к. его количественное изменение или потеря приводит к однонаправленному изменению показателей продуктивности. Основываясь на установленной роли биотипов в обеспечении определенного уровня продуктивности сорта, можно предположить, что варьирование в содержании основного биотипа, приводит к переопределению структуры сорта, что выражено изменением урожайности [15].

Полученные данные показывают, что в процессе семеноводства сорт претерпевает существенные изменения. Частоты отдельных биотипов могут быстро и значительно меняться в процессе пересева как под влиянием естественного, так и направленного отбора. Это приводит к существенному снижению продуктивности сорта, потере ряда его ценных признаков и свойств. Эти факты имеют и другую, юридическую сторону, ведь, по сути, под одним и тем же названием реализуется разный селекционный продукт. Поэтому в процессе семеноводства необходим контроль не только за урожайностью, но и за биотипным составом сорта, а использование микросателлитного анализа в процессе первичного и элитного семеноводства с обязательным составлением генетического паспорта передавае- мого на государственное испытание сорта, является в этой связи особенно важным [7].

Выводы. С помощью микросателлит-ного анализа с набором оригинальных пар праймеров была выявлена неоднородность сортов ярового рапса Булат и Форвард, проведена оценка частоты встречаемости аллелей и дифференциация сортов на биотипы, т.е. группы растений с различным аллельным составом и проведена их сравнительная оценка с исходными сортами по содержанию олеиновой кислоты.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект № RFMEFI62114X0003).