Использование молекулярно-генетических маркеров для идентификации генов чувствительности к фотопериоду в селекционном материале сои

Введение. Соя в России занимает второе место после подсолнечника среди масличных культур по площади возделывания и валовому сбору. Эта культура является ценным источником растительного белка, масла, витаминов, вторичных метаболитов и других питательных веществ. Основные области применения сои в России – это производство масла и белковых кормов. Площади посева сои в стране, согласно официальной статистике, ежегодно увеличиваются на 5–6 %, и только за 2022 г. было выделено 3,45 млн га сельхозугодий под возделывание культуры [1]. Этому способствует проводимая селекционная работа по расширению географии выращивания сои в более северных регионах России, чем было ранее.

Чувствительность к длине светового дня играет ключевую роль в регуляции роста, развития и цветения растений, особенно это важно для сои – одной из наиболее фоточувствительных культур. Способность сои адаптироваться к различным длинам дня и незначительно увеличивать вегетационный период при перемещении в регионы с большей его продолжительностью, является определяющим фактором, влияющим на период вегетации, цветение, урожайность и в целом на возможность возделывания того или иного сорта в условиях нетипичной для него длины дня. Идентификация рецессивных аллелей генов, ответственных за фотопериодическую чувствительность в сортах сои, является важным шагом в селекции и создании новых адаптивных и продуктивных сортов. Этот признак у сои контролируется генами E (Early). На сегодняшний день известно двенадцать таких генов, но наиболее существенный вклад в снижение чувствительности вносят гены Е1–Е4 [2].

Ген Е1 контролирует фактор транскрипции, выполняющий роль репрессора цветения. Для Е1 идентифицировано шесть аллелей, из которых e1-nl и e1-fs приводят к раннему цветению и полному подавлению экспрессии Е1 , e1-as определяет среднюю продолжительность цветения и частично подавляет действие Е1 [3; 4].

Ген Е2 – ингибитор цветения в условиях длинного дня, рецессивный аллель e2-ns , вызванный нонсенс-мутацией, имеет второе по важности значение в снижении фотопериодической реакции сои [2].

Гены Е3 и Е4 контролируют экспрессию фитохрома А (GmPhyA3 и GmPhyA2), который воздействует на цветение при разном соотношении красного света к дальнему красному (R/FR). При высоком R/FR в условиях длинного дня усиливается эффект гена Е3 , а при низком – Е4 . Также они запускают экспрессию Е1 , из-за чего наступает позднее цветение и при коротком, и при длинном дне. Но рецессивные аллели е3 и е4 снижают чувствительность к фотопериоду и способствуют раннему цветению в обоих условиях [5; 6; 7].

В настоящее время молекулярные методы, такие как ДНК-маркирование, стали неотъемлемой частью исследований в области генетики растений. С помощью маркеров возможно эффективно выявлять гены хозяйственно ценных признаков и контролировать их передачу от донора к реципиенту, что открывает новые перспективы для усовершенствования селекционных программ.

Целью нашего исследования было идентифицировать гены фотопериодической чувствительности в генотипах сои с использованием молекулярных маркеров.

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории молекулярно- генетических исследований отдела биологических исследований ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Объектом исследования служили шесть сортов (Баргузин, Элана, Рысь, Мамонт, Свапа, Арлета), пять линий поколений F6–F7 (2501, 2502, 2504, 2507, 2508), являющихся родительскими линиями пяти гибридов F1 : гибрид 1 (2502 × Арлета), гибрид 2 (Арлета × 2502), гибрид 3 (2502 × 2507), гибрид 4 (2502 × 2508), гибрид 5 (2504 × 2501). Контрольными вариантами по генам Е1, Е2, Е3 и Е4 выступали сорта Вильямс 82 и Harosoy, аллели данных генов ранее идентифицированы и описаны в литературе [3; 9].

Для экстракции ДНК использовались осевые органы зародыша, без предварительного проращивания. Выделение ДНК проводили с использованием набора реагентов для экстракции ДНК Экстран-3 (Синтол, РФ). Предварительно растительный материал измельчали с помощью гомогенезатора KZ-III-FP (Servicebio, КНР). Определение качества и количества выделенной ДНК осуществляли на микроспектрофотометре Nano-300 (Allsheng, КНР) в 3-кратной повторности на основании измерения оптической плотности раствора при длине волны 260 нм для нуклеиновых кислот (НК), 280 – для белков и фенолов, 230 – для других органических соединений. Оптимальным соотношением оптических плотностей, полученных при 260/280 нм и 260/230 нм, считали значение от 1,8 до 2,2.

ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл 10x ПЦР-Буфер-Б; 0,2 мM каждого dNTP; по 10 пМ каждого праймера; 100 нг матричной ДНК и 1 ед. SynTaq ДНК-полимеразы (Синтол, РФ). Амплификация выполнялась в термоциклере GeneExplorer GE-96S (BIOER, Китай).

Для маркирования были выбраны четыре гена, отвечающие за чувствительность к фотопериоду: E1 , Е2 , Е3 и Е4 . Для идентификации исследуемых генов использовались ДНК-маркеры, ранее разработанные зарубежными и отечественными авторами, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1

Молекулярные маркеры, примененные в исследовании

Ген	Лока-лиза-ция (хромо-сома)	Последовательность праймеров	Длина ПЦР-продуктов, п.н.	Источник
E1	6	F11: CACTCAAATTA AGCCCTTTCA R21: TCCGATCTCAT CACCTTTCC F2: GGGAGCAGTG TCAAAAGAAGAG R2: GTGCTATCCCT TAGTTAATTAAATA F3: GGGAGCAGTGT CAAAAGAAGAC R3: GTGCTATCCCT TAGTTAATTAAATT	E1/e1-as/e1-fs – 547 Е1 – 1403 e1-as – 1403	[2] [8]
Е2	10	F: GAAGCCCATCAG AGGCATGTCTTATT R: AAGCCTATGC CAGCTAGGTATTT	E2 – 130 e2-ns – 107+23	[3]
Е3	19	F: TGGAGGGTATT GGATGATGC R1: CTAAGTCCGC CT CTGGTTTCAG R2: CGGTCAAGAGC CAACATGAG R3: GTCCTATACAA TTCTTTACGACG	E3-Mi – 1339 E3-Ha – 558 e3-tr – 275	[6]
E4	20	F: AGACGTAGTG CTAGGGCTAT R1: GCATCTCGCAT CACCAGATCA R2: GCTCATCCCTT C GAATTCAG	E4 – 1229 e4-SORE-1 – 837	[5]

1 – прямой праймер

2 – обратный праймер

Параметры амплификации: предварительная денатурация (95 ℃) – 5 мин;

40 циклов: денатурация (95 ℃) – 10 сек, гибридизация (55–60 ℃) – 20 сек, элонгация (72 ℃) – 35 сек; финальная элонгация (72 ℃) – 5 мин.

Продукты амплификации с парой праймеров Е2FR обрабатывали эндонуклеазой рестрикции DraI , согласно протоколу изготовителя (СибЭнзим, РФ).

Разделение ПЦР-продуктов методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле проводили в камере для горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, РФ). Параметры силы тока и напряжения – 90 mA, 5

180 V. Гели окрашивали бромидом этидия и визуализировали фрагменты ДНК при помощи гель-документирующей системы GenoSens Touch 2200 в УФ-свечении. Размер фрагментов определяли с помощью маркеров молекулярного веса 100–1000 п.н. (Синтол, РФ) и 100 + bp DNA Ledder (Евроген, РФ).

Результаты и обсуждение. Для идентификации аллелей гена Е1 в изучаемых генотипах использовали три пары праймеров. Праймеры Е1F1R1 являются общими для доминантного Е1 и рецессивных аллелей е1-as , e1-fs . Отсутствие гибридизации свидетельствует о наличии рецессивного аллеля e1-nl. Праймеры на Е1 и е1-as амплифицируют фрагменты одной длины 1403 п.н., но имеется одна нуклеотидная замена, в связи с чем аллель e1-as вносит изменения в работу гена. Праймеры Е1F2R2 гибриди-зуются только в образцах с наличием аллеля Е1 , а Е1F3R3 – только с аллелем e1-as . В нашей работе все проанализированные образцы характеризовались наличием аллеля e1-as (рис. 1а), кроме сорта Мамонт, у которого был идентифицирован аллель Е1 (рис. 1б). Аллель e1-nl выявлен не был.

Рисунок 1 – Электрофоретические спектры ПЦР-продуктов, полученных с помощью праймеров Е1F3R3 ( а ) и Е1F2R2 ( б ).

Дорожки: а) 1 - Вильямс 82; 2 - Harosoy;

3 – Баргузин; 4 – Мамонт; 5 – Рысь; 6 – Элана;

7 – Свапа; 8 – Арлета; 9 – 2501; 10 – 2502; 11 – 2504;

12 – 2507; 13 – 2508;

б) 1 - Вильямс 82; 2 - Harosoy; 3, 4 - Мамонт;

5, 6 – Свапа; 7, 8 – Элана

Для изучения аллельного состояния гена Е2 применяли СAPS-маркер, кото-6

рый идентифицировал фрагмент длиной 130 п.н. во всех образцах. Отличие в нуклеотидных последовательностях доминантного аллеля Е2 от рецессивного е2-ns – однонуклеотидная замена аденина на тимин, которая затрагивает сайт распознавания эндонуклеазы DraI. Поэтому после проведения гидролиза ампликоны, имеющие данную трансверсию, разрезаются на фрагменты длиною 107 и 23 п.н., что соответствует рецессивному аллелю е2-ns . Фрагменты с аденином не подвергаются рестрикции, что свидетельствует о наличии в этих образцах доминантного аллеля Е2 . В исследуемой выборке у всех образцов идентифицирован рецессивный аллель е2-ns (рис. 2). Только у сорта Вильямс 82 обнаружен аллель Е2 , что соответствует литературным данным [4].

Рисунок 2 – Электрофоретические спектры ПЦР-продуктов, полученных с помощью пары праймеров Е2 (после обработки DraI ).

Дорожки: 1 – Баргузин; 2 – Элана; 3 – Рысь;

4 – Мамонт; 5 – Свапа; 6 – Арлета; 7 – 2501;

8 – 2502; 9 – 2504; 10 – 2507; 11 – 2508;

12 – Вильямс 82; 13 – Harosoy

Ген Е3 имеет четыре аллеля (E3-Mi, E3-Ha, e3-tr, e3-fs), два из которых рецессивные: e3-tr и e3-fs. В нашем исследовании мы идентифицировали только аллели Е3-На и е3-tr. Маркер аллеля Е3-Ha имеет длину фрагмента в 558 п.н., был обнаружен у сортов Рысь, Мамонт, Свапа, линий 2501, 2502 и 2508, а также у гибрида 4. Маркер аллеля e3-tr – 275 п.н. наблюдался у сортов Элана, Баргузин и Арлета, линий 2504 и 2507. У гибридов 1, 2, 3 и 5 ген Е3 находится в гетерозиготном состоянии (Е3-Ha/e3-tr) (рис. 3). Но важно отметить, что аллель e3-fs отличается от аллеля E3-Ha инсерцией тимина, которая является фреймшифт-мутацией (мутация рамки считывания), в результате происходит сдвиг рамки считывания при транскрипции мРНК. Это приводит к появлению стоп-кодона в экзоне 1 и преждевременной терминации синтеза белка [9]. Поэтому, потенциально, при идентификации аллеля Е3-Ha доминантный аллель может быть ошибочно идентифицирован как рецессивный. Точное определение e3-fs возможно секвенированием амплифицированной последовательности [8], но в нашей работе этого не проводилось.

Рисунок 3 – Электрофоретические спектры ПЦР-продуктов, полученных с помощью праймеров на ген Е3 .

Дорожки: 1 – Вильямс 82; 2 – Harosoy; 3 – Баргузин; 4 – Элана; 5 – Рысь; 6 – Мамонт; 7 – Свапа; 8 – 2501;

9 – 2502; 10 – 2504; 11 – 2507; 12 – 2508;

13 – Арлета; 14 – Гибрид 1; 15 – Гибрид 2;

16 – Гибрид 3; 17 – Гибрид 4; 18 – Гибрид 5

Из литературы известно, что ген Е4 имеет широкое разнообразие рецессивных аллелей ( е4-SORE-1, e4-kes, e4-oto, e4-tsu, e4-kam ), но наиболее распространен аллель е4-SORE-1, остальные характерны для сортов китайской и японской селекции [5]. Данный е4 -специфичный маркерный фрагмент ДНК длиной 837 п.н. выявлен в сортах Элана, Баргузин, Свапа и линии 2508. Все остальные генотипы характеризуются доминантным аллелем Е4 – 1229 п.н. (рис. 4). Однако стоит отметить, что у линии 2502 присутствует аллель Е4 , у 2508 – е4-SORE-1 , а их гибрид 4 находится в гомозиготном состоянии по Е4 , что может быть вызвано ошибкой отбора растений из общей популяции линии 2508, которая представлена поколением F 6 , где еще продолжается расщепление гибридной популяции.

Рисунок 4 – Электрофоретические спектры ПЦР-продуктов, полученных с помощью праймеров маркера гена Е4 .

Дорожки: 1 – Вильямс 82; 2 – Harosoy; 3 – Баргузин; 4 – Элана; 5 – Рысь; 6 – Мамонт; 7 – Свапа; 8 – 2501;

9 – 2502; 10 – 2504; 11 – 2507; 12 – 2508;

13 – Арлета; 14 – Гибрид 1; 15 – Гибрид 2;

16 – Гибрид 3; 17 – Гибрид 4; 18 – Гибрид 5

Известно, что генотипы с максимальным количеством рецессивных аллелей снижают чувствительность к фотопериоду у сои в северных и южных широтах, обеспечивая раннее цветение и созревание [7]. Результаты идентификации генов Е1-Е4 у всех изученных генотипов сои представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты оценки генотипов сои по молекулярным маркерам и группе спелости

Сорт	Ген/аллель				Группа спело-сти*
	E1/e1-as	Е2/е2-ns	E3-Ha/e3-tr	E4/e4-SORE
Вильямс 82 (к)	e1-as	E2	E3-Ha	E4	–
Harosoy (к)	e1-as	е2-ns	E3-Ha	E4	–
Баргузин	e1-as	е2-ns	e3-tr	e4-SORE-1	2
Элана	e1-as	e2-ns	e3-tr	e4-SORE-1	2
Рысь	e1-as	е2-ns	E3-Ha	E4	4
Мамонт	E1	е2-ns	E3-Ha	E4	5
Свапа	e1-as	е2-ns	E3-Ha	e4-SORE-1	3
Арлета	e1-as	е2-ns	e3-tr	E4	3
Линия 2501	e1-as	е2-ns	E3-Ha	E4	4
Линия 2502	e1-as	е2-ns	E3-Ha	E4	4
Линия 2504	e1-as	е2-ns	e3-tr	E4	4
Линия 2507	e1-as	е2-ns	e3-tr	E4	3
Линия 2508	e1-as	е2-ns	E3-Ha	e4-SORE-1	3
Гибрид 1 2502 × Арлета	e1-as	е2-ns	E3-Ha/ e3-tr	E4	3
Гибрид 2 Арлета × 2502	e1-as	е2-ns	E3-Ha/ e3-tr	E4	3
Гибрид 3 2502 × 2507	e1-as	е2-ns	E3-Ha/ e3-tr	E4	3
Гибрид 4 2502 × 2508	e1-as	е2-ns	E3-Ha	E4	4
Гибрид 5 2504 × 2501	e1-as	е2-ns	E3-Ha/ e3-tr	E4	3