Использование морских одноклеточных водорослей в биологическом мониторинге

При проведении биологического мониторинга состояния морских экосистем широкое распространение получили методы биологического тестирования с использованием лабораторных культур одноклеточных водорослей. В водных экосистемах планктонные водоросли являются не только основными первичными продуцентами органического вещества, но и могут служить биологическими индикаторами функционирования фитопланктонного сообщества при загрязнении водной среды. Преимущество использования одноклеточных водорослей состоит в том, что они имеют короткий жизненный цикл, это позволяет оценивать экологические последствия воздействия антропогенного фактора в ряду поколений как на клеточном, так и на популяционном уровнях организации сообщества. Поскольку разные виды морских водорослей обладают различной резистентной устойчивостью ко многим загрязняющим веществам водной среды, включая тяжелые металлы, то при осуществлении биологического тестирования предлагается использовать широкий таксономический спектр водорослей. К сожалению, до последнего времени в экспериментах по биологическому тестированию в основном использовались пресноводные зеленые хлорококковые водоросли, традиционно культивируемые в лабораторных условиях. Морские планктонные водоросли в качестве объекта при тестировании загрязнения среды, за исключением диатомовых водорослей, используются значительно реже [1–4].

Целью работы явилось исследование возможности использования морских одноклеточных водорослей, выделенных из природного планктонного сообщества, в биомониторинге загрязнения моря тяжелыми металлами. В задачи исследования входило: выделение из фитопланктонного сообщества водорослей разных систематических групп в лабораторные культуры; подбор унифицированной питательной среды и условий культивирования водорослей; определение устойчивости водорослей разных таксонов к тяжелым металлам в модельных опытах.

Выбор тест-объекта при биологическом тестировании составляет одну из важнейших задач при проведении биотестирования и мониторинга загрязнения окружающей среды. При разработке стандартных условий тестирования с использованием водорослей тест-объект должен удовлетворять нескольким основным требованиям. Водоросли должны быть эврибионтными, широко представленными в планктонном сообществе определенной экосистемы. Они должны легко культивироваться в лабораторных условиях на стандартных средах, обеспечивая константный и однообразный рост культуры. Тестируемые водоросли должны иметь в цикле развития покоящиеся стадии – споры, сохраняя при этом активный рост без образования цист. Для целей тестирования лучше подходят одноклеточные водоросли, выделенные из природного планктона исследуемой экосистемы, идентифицированные до вида и размножающиеся преимущественно путем бинарного деления в синхронно развивающейся культуре.

В течение ряда лет авторами были проведены экспериментальные исследования по подбору условий культивирования морских одноклеточных водорослей различных таксономических групп с последующим использованием их в качестве тест-объекта при изучении ответных реакций на загрязнение водной среды тяжелыми металлами.

Материалы и методы

В работе использовали культуры одноклеточных морских водорослей разных таксономических рангов из коллекции Морской станции (Station Marine d’Endoume, Marseille, France), выделенные из Марсельского залива Средиземного моря. Водоросли культивировали на специально подобранной среде, обеспечивающей оптимальный рост каждого вида в лабораторных условиях. При подборе среды для тестирования исходили из условий максимального приближения ее состава к природной воде, минимизируя при этом комбинацию и концентрации химических соединений, вносимых в морскую воду, предварительно отфильтрованную через мембранный фильтр 0,22 µк.

Опыты проводили в стеклянных колбах емкостью 250 мл со 100 мл культуры водорослей при температуре 18–20 °С с заранее установленной исходной численностью клеток, обеспечивающей оптимальный рост каждого вида водорослей. Выбранные начальные численности водорослей обеспечивали хорошую сходимость измеряемых параметров при тестировании, включая определение фотосинтетических пигментов.

Водоросли культивировали при освещенности 1,5 µВт/cм² при фотопериоде 14 : 10 (свет : темнота). Численность клеток водорослей определяли в счетной камере Нажотта объемом 1/20 мл, просчитывая не менее 1500 клеток в каждой пробе. Биомассу водорослей определяли расчетным методом геометрического подобия, измеряя линейные размеры клеток и рассчитывая их объем, принимая 1 мкм³ равным 1 пг [5].

Концентрацию пигментов в клетках определяли спектрографическим методом. Пробы фильтровали через мембранные фильтры GC-50, предварительно пропустив сквозь него 5 мл суспензии углекислого магния для предотвращения деградации хлорофилла "а". Пигменты экстрагировали 90%-м водным раствором ацетона при 4 °С в условиях затемнения после разрушения клеток в стеклянном гомогенизаторе. Содержание феофитина "а" определяли по изменению оптической плотности вытяжки пигментов при 430, 665 и 750 нм, добавляя в кювету 0,1 мл 0,1 N HCl непосредственно после того, как в пробе была измерена концентрация хлорофилла "а" [6].

Соли тяжелых металлов (ртути, кадмия, меди, свинца) во избежание преципитации фосфатов и солей железа стерилизовали методом фильтрации и вносили после стандартной стерилизации основной среды в начале фазы экспоненциального роста культуры водорослей. Скрининг токсичности тяжелых металлов для водорослей проводили в концентрациях 1–2000 мкгМе/л (с интервалом 2,5 мкг/л – от 5 до 25 мкг/л, с интервалом 25 мкг/л – от 25 до 100 мкг/л, с интервалом 100 мкг/л – от 100 до 500 мкг/л, с интервалом 250 мкг/л – от 1 000 до 2000 мкг/л).

Результаты и обсуждение

В предварительных опытах был подобран оптимальный вариант питательной среды, на которой хорошо росли морские водоросли разных таксонов: диатомовые, ксантофициевые, криптофициевые, хризофициевые и одноклеточные красные водоросли.

Была установлена также начальная плотность в интервале (5–30) × 10³ кл/мл для разных по объему клеток водорослей. При такой стартовой плотности культуры водорослей деление клеток происходило через регулярные интервалы и составляло 1,5–1,6 делений в сутки. При увеличении начальной плотности культуры происходил резкий рост численности, повышалось содержание деривата хлорофилла "а" – феофитина в составе фотосинтетических пигментов, а также возрастало число деградированных клеток и выделение в среду вторичных метаболитов. Последнее оказалось нежелательным при тестировании токсичности тяжелых металлов, поскольку могло привести к искажению получаемых данных в результате связывания металлов в комплексы.

В итоге были найдены оптимальные условия для морских одноклеточных водорослей, выделенных из планктонного сообщества и выращиваемых в лаборатории в условиях аксеничных культур на обогащенной биогенными элементами унифицированной среде, включая начальную плотность, освещенность, фотопериод и температуру культивирования (табл. 1).

Эксперименты с тяжелыми металлами выявили различную устойчивость водорослей к определенному металлу, не только относящихся к разным отделам, но и к видам одной и той же таксономической группы. Причем устойчивость водоросли к действию одного из тяжелых металлов, как было установлено, не предопределяет толерантность к другим испытанным металлам. Так, среди пяти видов диатомовых, наиболее массово представленных в морском планктоне, токсическое действие испытанных металлов различалось иногда на два порядка. Наиболее токсичной для водорослей оказалась ртуть, которая в концентрациях 5–10 мкг/л ингибировала рост культуры, который выражался в удлинении лаг-фазы роста, снижении содержания хлорофилла и скорости деления клеток. Высокая чувствительность к воздействию кадмия, как оказалось, свойственна диатомовой водоросли Cylindrotheca clostertium, а к соли меди другой диатомеи – Chaetoceros didymus. Среди зеленых водорослей наиболее устойчивой к испытанным тяжелым металлам была Prasinocladus marinus, в то время как другая зеленая водоросль – Chlamydomonas palla – оказалась более чувствительной к наличию в среде металлов (табл. 2). Различия в устойчивости водорослей разных таксономических групп обусловлены разными механизмами действия тяжелых металлов как в зависимости от их концентрации в среде, так и особенностями метаболизма и морфологией водорослевых клеток. Ранее было показано, что отклики водорослевых клеток на добавки в среду летальных и сублетальных концентраций тяжелых металлов существенно различаются. Внесение в среду высоких доз тяжелого металла вызывает мгновенную гибель клеток, затушевывая тонкие механизмы токсичности и ответные реакции водорослей, включая нарушение проницаемости клеточных мембран, сопровождающееся выходом ионов К+ из клеток; нарушение клеточного цикла в результате блокировки их деления; появление в культуре клеток с измененной морфологией; снижение содержания хлорофилла "а" на фоне увеличения доли феофитина в клетках; аккумуляции металла водорослями в результате связывания МТ-белками и фитохелатинами и т. д. [4; 7; 8].

Таблица 1. Состав экспериментальной унифицированной среды Table 1. Composition of the experimental unified medium

Морская вода	900 мл
KNO 3	200 µМ
Na 2 HPO 4 × H 2 O	20 µМ
Na 2 SiO 3 × 9H 2 O	120 µМ
FeCl 3 × 3H 2 O	4 µМ
TRIS	2 µМ
Thiamine	600 нмоль
Biotine	1,6 нмоль
B 12	0,55 нмоль
pH	7,8
Соленость	35 ‰

Таблица 2. Пороговые и летальные концентрации тяжелых металлов в мкг/л металла для культур морских водорослей

Table 2. Threshold and lethal concentrations of heavy metals (µg/l) for cultures of marine algae

Водоросли	Металлы (мкг/л)
	HgCl 2	CdCl 2	CuCl 2	PbCl 2
Chlamydomonas palla	5–25 15*	25–500 200	50–150 100	500–2000 1000
Prasinocladus marinus	10–50 25	50 ≥ 500 > 250	50 ≥ 250 150	500 ≥ 2000 > 1000
Pavlova pinguis	5–20 10	25 ≥ 100 50	250 ≥ 500 > 250	500 ≥ 2000 1000
Chaetoceros didymus	5–20 15	50 ≥ 100 >> 75	25 ≥ 50 > 25	1000 ≥ 2000 >> 1000
Cylindrotheca closterium	10–20 7,5	5–50 25	100 ≥ 500 250	>>> 2000
Fragilaria pinnata	5–25 15	50 ≥ 250 100	250 ≥ 1000 500	>>> 2000
Lauderia borealis	5–10 > 5	50 ≥ 250 100	25 ≥ 150 < 100	500–1 000 << 750
Phaeodactylum tricornutum	5–25 15	100 ≥ 1000 500	500 ≥ 1000 < 1000	1000 ≥ 2000 >> 1000
Monallanthus salina	5–25 10	50–250 100	100–1 000 500	>>> 2000
Cryptomonas pseudobaltica	10–25 12,5	25–500 100	50–500 250	1000 ≥ 2000 >> 1000
Exuviaella mariae-lebouriae	5–15 7,5	50–250 100	10–20 15	1 000–2000 > 1000
Porphyridium marinum	5–25 15	25 ≥ 500 250	10–50 25	250–1 000 > 500

Примечание. * – в знаменателе дана концентрация металла, ингибирующая рост культуры на 50 % по сравнению с контролем.

Разная устойчивость водорослей к одному и тому же металлу делает необходимым использование набора видов при оценке последствий загрязнения среды тяжелыми металлами, поскольку в составе каждой таксономической группы встречаются виды, обладающие разной резистентной устойчивостью, которая обеспечивает сохранение их в планктонном сообществе в условиях антропогенного пресса. Стресс-толерантность, по-видимому, является генетически закрепленным свойством и частью общей устойчивости водорослей, выделенных ранее в культуру из морского фитопланктона. Ответные реакции водорослей на добавки в среду солей тяжелых металлов в сублетальных концентрациях, как уже отмечалось, сопровождались резким падением скорости деления водорослевых клеток. Нарушение скорости деления клеток, возможно, связанное с ингибированием ферментных систем клетки, регулирующих процесс митоза, приводило к снижению численности популяции водорослей в присутствии тяжелых металлов. Ранее было показано, что тяжелые металлы с высокой цитотоксичностью ингибируют клеточный цикл на стадии G2-M, в течение которой в клетках происходят интенсивные процессы биосинтеза [9].

Следствием нарушения клеточного цикла у водорослей под действием тяжелых металлов являются морфологические изменения клеток, которые наиболее отчетливо проявляются у диатомовых водорослей. Специфический способ деления диатомовых водорослей, при котором одна из дочерних клеток оказывается меньше другой, приводит к изменению размера клеток внутри популяции. Переход от мелких по объему клеток к нормальным осуществляется посредством ауксоспор в результате полового размножения диатомовых водорослей. Наличие в среде тяжелых металлов приводит к более существенному изменению размера клеток в популяции диатомовых водорослей. Ранее в опытах с диатомеей Skeletonema costatum было показало, что культура в присутствии тяжелых металлов представляет собой гетерогенную размерную популяцию, в которой размеры клеток различаются в результате уменьшения объема при добавках меди и появления "гигантских" клеток в среде с ртутью и кадмием [1].

Морфологическое изменение клеток в присутствии сублетальных концентраций тяжелых металлов является важным информативным показателем состояния культуры, свидетельствующим о блокировании механизма клеточного деления, который сопровождается увеличением времени генерации водорослей. Установлено также, что водоросли с высокой удельной поверхностью клеток (S/V) более чувствительны к действию солей тяжелых металлов, поскольку имеют больший контакт со средой, содержащей токсичный металл. Было установлено, что клетки, образующие цепочки, неодинаково реагируют на токсичный металл. Морфологические изменения характерны для крайних клеток в колонии и цепочке водорослей [7].

Токсическое действие тяжелых металлов сопровождалось снижением содержания фотосинтетических пигментов в клетках водорослей. Особенно существенно уменьшалось содержание хлорофилла "а" при внесении в среду солей ртути и меди даже при некотором росте численности водорослевых клеток. При этом падение содержания хлорофилла происходило на фоне роста количества его неактивной формы – феофитина "а", концентрация которого в присутствии тяжелых металлов уже на 2–3 сутки опыта достигала 50 %, в то время как у контрольных водорослей доля феофитина "а" заметно возрастала лишь во время стационарной фазы роста.

Показатели состояния и функционирования фотосинтетического аппарата оказываются наиболее значимыми в оценке степени повреждения водорослевой клетки. Причем главной системой, защищающей фотосинтетические пигменты от деструкции, является сам процесс фотосинтеза. Поэтому процессы деградации основного фотосинтетического пигмента – хлорофилла "а" – начинаются только после ингибирования фотосинтеза. Нарушение процесса фотосинтеза, которое выражается в полном блокировании фотосинтетической электронно-транспортной цепи, создает условия для протекания деградации пигментов. Ингибирование высокотоксичными тяжелыми металлами фотосинтетического аппарата клетки и окислительное разрушение хлорофилла приводят в итоге к гибели водорослевых клеток [10; 11].

По результатам иерархического кластерного анализа можно с достаточной степенью достоверности считать, что виды водорослей обладают сходной ответной реакцией на тяжелые металлы. Данные, приведенные в табл. 3, показывают, что в одни кластеры группировались экологически близкие виды, относящиеся как к одинаковым, так и разным таксономическим рангам. Сопоставление данных по пороговым и летальным концентрациям тяжелых металлов с результатами кластерного анализа свидетельствует о том, что среди испытанных водорослей встречаются виды, обладающие как резистентной, так и упругой устойчивостью к тяжелым металлам. Скрининг наиболее опасных тяжелых металлов в отношении водорослей разных таксонов позволяет получать данные, которые способствуют лучшему пониманию наблюдаемых в фитопланктонном сообществе антропогенных сукцессий в условиях загрязнения среды [12].

В предыдущих экспериментах in situ, в которых изучалось влияние тяжелых металлов на морской фитопланктон, элиминация чувствительных видов диатомовых водорослей приводила к смене доминирующих видов и нарушению структуры планктонного сообщества. Фитопланктон в опытных контейнерах до добавок в среду отдельных тяжелых металлов и их комбинаций был представлен 33 видами водорослей, среди которых диатомовые составляли более 80 %. Структурными доминантами были ^avicula sp., Ditylum brightwellii и Chaetoceros constrictus. После добавки в среду солей кадмия и меди уже на 2–3 сутки опыта преимущество в росте получила С-стратег Thalassionema nitzschioides с высокой скоростью увеличения численности популяции и способностью к гетеротрофному питанию [8].

Таблица 3. Виды водорослей со сходной устойчивостью к действию тяжелых металлов Table 3. Species of marine algae with similar stability to action of heavy metals

Металл	Водоросли с низкой пороговой и летальной дозами	Водоросли с высокой пороговой и летальной дозами
Ртуть (HgCl 2 )	Lauderia borealis Pavlova pinguis Exuviaella mariae-lebouriae	Prasinocladus marinus Cryptomonas pseudobaltica
Кадмий (CdCl 2 )	Cylindrotheca closterium Chaetoceros didymus Pavlova pinguis	Phaeodactylum tricornutum Prasinocladus marinus
Свинец (PbCl 2 )	Porphyridium marinum Chlamydomona palla Pavlova pinguis	Fragilaria pinnata Cylindrotheca closterium Monallantus salina
Медь (CuCl 2 )	Exuviaella mariae-lebouriae Porphyridium marinum Chaetoceros didimus Lauderia borealis	Phaeodactylum tricornutum Fragilaria pinnata Pavlova pinguis Monallantus salina Cylindrotheca closterium

Формирование структуры фитопланктона в водных экосистемах осуществляется посредством выделяемых водорослями метаболитов, регулирующих численность собственной популяции и партнеров по сообществу. Регуляция численности посредством первичных и вторичных метаболитов водорослей является основным механизмом, контролирующим развитие популяций и их сукцессии в планктонном сообществе [13]. Выделяемые планктонными водорослями первичные и вторичные метаболиты изменяют условия существования отдельных видов и в условиях смешанных лабораторных культур. Известно, что фильтраты культуры диатомовой водоросли Skeletonema costatum ингибировали как собственный рост, так и деление клеток другой диатомеи – Thalassiosira caspica, стимулируя при этом развитие Chaetoceros curvisetus [14].

Заключение

При проведении биологического мониторинга загрязнения морской среды тяжелыми металлами и другими опасными токсикантами необходимы как полевые, так и лабораторные исследования с использованием одноклеточных планктонных водорослей разных таксонов в качестве тест-объекта. При этом важнейшими показателями состояния водорослевого сообщества являются клеточный цикл и состояние фотосинтетического аппарата клетки. Последующий лизис клеток под действием тяжелых металлов приводит к выделению в среду вторичных метаболитов, которые могут существенно влиять на токсичность металла. Можно полагать, что выделенные из планктонного сообщества водоросли в лабораторных условиях монокультуры сохраняют механизмы регуляции численности собственной популяции. Гибель водорослевых клеток под действием тяжелых металлов резко увеличивает содержание в среде вторичных метаболитов, которые, по-видимому, являются триггером в запуске и формировании своеобразной "цепной" реакции деградации водорослевых клеток в опытных сосудах.

Таким образом, установленные шкалы пороговых и летальных концентраций тяжелых металлов для водорослей разных таксонов позволяют использовать соотношение чувствительных и устойчивых к тяжелым металлам видов в качестве биологических маркеров при прогнозировании экологических последствий загрязнения морской среды тяжелыми металлами. Различия в устойчивости водорослей разных таксонов к тяжелым металлам позволяют осуществлять стратегию отбора тест-объектов в зависимости от целей и задач исследования, учитывая тот факт, что результаты биотестирования лишь дополняют эксперименты, которые используются в прогнозах экологического состояния морского планктонного сообщества.