Использование различных имплантационных материалов в реконструктивной хирургии. Экспериментальное исследование

Актуальность

В настоящее время проводятся активные исследования, посвященные изучению способов повышения интеграции различных имплантатов и трансплантатов в реконструктивной хирургии. Перспективным методом считается применение факторов роста непосредственно в области хирургического вмешательства, которые играют ведущую роль в стимуляции и регуляции процессов заживления ран в организме (A. Garg, D. Gargenese, I. Peace, 2000).

К факторам, которые первыми запускают каскад процессов регенерации, относятся полученные из тромбоцитов факторы роста и трансформирующие факторы роста (R. Marx, 2001). Богатая тромбоцитами плазма (PRP, БоТП) представляет собой «выжимку» из аутокрови, содержащую тромбоциты в количестве, превышающем исходное. БоТП стимулирует ангиогенез и митоз клеток, которые участвуют в процессе регенерации. В силу этого, БоТП не может значительно улучшить характеристики неклеточных костных материалов (R. Marx, E. Carlson 1998). Однако, поскольку сокращение сроков роста и созревания кости было продемонстрировано при применении аутогенной кости и БоТП, то можно предположить, что применение комбинации различных имплантационных материалов и БоТП тоже приведет к увеличению скорости интеграции и заживления послеоперационной раны. В исследованиях Y. Foukaya с соавт. (2012) достоверно доказано уменьшение апоптоза клеток адипоцитов в культуре in vitro при добавлении к ним богатой тромбоцитами плазмы.

Вышеуказанные данные свидетельствуют о большом потенциале обогащенной тромбоцитами плазмы при хирургических операциях и являются стимулом для использования ее в клинической практике.

Для обоснования возможности использования различных имплантационных материалов в комбинации с богатой тромбоцитами плазмой в реконструктивной хирургии нами был проведен эксперимент.

Целью экспериментального исследования стало изучение свойств и взаимодействия богатой тромбоцитами плазмы с различными имплантационными материалами, наиболее часто применяемыми в практике, в эксперименте на животных.

Основные задачи экспериментального исследования:

– на основе морфогистологических исследований определить реакцию окружающих тканей на костный, хрящевой трансплантат (взят у крыс, не участвующих в эксперименте), силикон, пористый биосовместимый полиэтилен («Medpor», производитель «Stryker®», США), а также комбинации указанных материалов с богатой тромбоцитами плазмой;

– определить выраженность воспалительной реакции, степень миграции, резорбции и замещения соединительной тканью имплантируемого материала.

Материалы и методы

Эксперимент провели на 36 половозрелых самцах крыс линии Вистар весом от 170 до 250 г.

Данное исследование выполняли в соответствии с ГОСТ 10993.6 – 2009 и с требованиями Правил лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.2010).

Все манипуляции с животными были проведены согласно принципам гуманного отношения к животным в соответствии с Международными рекомендациями, а также с соблюдением биоэтических норм и требований Международного комитета по науке.

Животных содержали в стандартных условиях, соответствующих Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), группами по 9 особей в поликарбонатных клетках. В качестве подстила использовали древесные опилки лиственных пород.

Животные получали стандартный гранулированный корм для лабораторных грызунов ПК 120-899. Микробиологический статус кормов соответствует ГОСТ Р 51849-2001 «Ветеринарно-санитарные нормы и требования к качеству кормов для непродуктивных животных» и не оказывает негативного влияния на результаты проводимого теста. Фильтрованную водопроводную воду давали в стандартных питьевых бутылочках. Микробиологический статус воды соответствует СанПиН 2.1.4.1074-01 «Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения» и не оказывает негативного влияния на результаты проводимого теста.

Животные были адаптированы в лаборатории в течение 14 дней до начала эксперимента. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. Во время карантина все крысы оставались здоровыми.

Животных распределяли по группам рандомизи-рованно.

Каждому животному присваивали индивидуальный номер, помечаемый индивидуальным окрашиванием, и фиксируемый на карточке клетки.

Дизайн исследования:

Образцы, использованные в эксперименте

• 1.    Силикон;

• 2.    «Medpor», производитель «Stryker®», США;

• 3.    Кость (аутокость), взятая из кончика хвоста крыс;

• 4.    Хрящ, взятый из уха крыс, не участвующих в эксперименте.

Подготовка богатой тромбоцитами плазмы крови

У крыс, не участвующих в дальнейшем эксперименте, производили забор крови в пластиковую пробирку с антикоагулянтом (3,8% раствор цитрата натрия) в соотношении 1 : 9, центрифугировали при 1200 об/мин. (около 300g) в течение 5 минут и собирали супернатант.

Подготовка образцов

Силикон и «Medpor» были представлены на исследования в готовом виде. Кость извлекали из кончика хвоста имплантируемой крысы (аутокость). Хрящ извлекали из уха интактной крысы.

Для обработки тестируемых материалов богатой тромбоцитами плазмой крови образцы помещали в плазму и добавляли 10% раствор хлористого кальция (из расчета 1мл плазмы – 4 капли раствора) до образования гелеобразной массы, после чего образцы имплантировали в теменно-затылочную область крыс под надкостницу (рис. 1).

Формирование групп

Крысы были разделены на 4 группы методом случайной выборки. Имплантацию производили с двух сторон (стороны L и R): в левую сторону (L) имплантировали чистый материал, в правую (R) – тот же материал, но выдержанный в плазме (рис. 2).

Группы распределились следующим образом:

• a.    Группа №1 – L- силикон; R- силикон с богатой тромбоцитами плазмой;

• b.    Группа №2– L- «Medpor»; R- «Medpor» с богатой тромбоцитами плазмой;

• c.    Группа №3 – L-кость; R- кость с богатой тромбоцитами плазмой;

• d.    Группа №4 – L-хрящ; R- хрящ с богатой тромбоцитами плазмой.

Подготовка к имплантации

За 24 часа до начала проведения исследования животных не кормили. Перед имплантацией крысам проводили общую анестезию.

В области имплантации выбривали шерсть.

Проведение имплантации

Место имплантации обрабатывали раствором спирта (70%). В асептических условиях с помощью одноразовых скальпелей производили 2 разреза в теменнозатылочной области. С левой стороны под надкостницу помещали нативный материал, справа – обработанный

Рис. 1. Имплантируемые образцы

Рис. 2. Зона имплантации

богатой тромбоцитами плазмой. Раны ушивали рассасывающимся шовным материалом «MONOCRYL*Plus» фирмы «Eticon».

Наблюдение за животными

На протяжении исследования вели наблюдение за каждым животным. Объектом ежедневного контроля были:

– общий вид (шерстный покров, глаза, уши, конечности, зубы);

– состояние и поведение (активность, походка, темперамент, питание); физиологические функции (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет);

– заживление ран (сроки заживления, наличие инфекции, гематом, некротических тканей, тип заживления).

Этапы исследования

Животных из эксперимента выводили в 3 этапа: 2 недели, 1 месяц, 3 месяца после имплантации.

Сразу после гибели производили забор материала из зоны имплантации вместе с образцами для гистологических

Рис. 3. Фото и гистограмма зоны имплантации у животных 1 группы на 14 сутки

исследований. Ткани с образцами, извлеченные после эвтаназии, подвергали обработке: фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин по общепринятой методике, изготовляли серийные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином и по методу Маллори. Образцы с костной тканью предварительно подвергали декальцинированию с помощью раствора Трилона Б.

Результаты исследования

Группа 1 (имплантируемый материал – силикон), 14-сутки после имплантации.

Признаков воспалительной реакции мы не наблюдали, однако определялось значительное смещение имплантата слева (3 балла), тогда как комбинация синтетического материала и плазмы ограничивала миграцию имплантата (2 балла).

При гистологическом исследовании препаратов – микроскопческая картина стадии формирования многослойной соединительнотканной капсулы. В воспалительный процесс вовлечены окружающие ткани, в которых присутствуют форменные элементы крови, гигантские клетки воспалительного ряда, нейтрофилы. Исследование биоптата с силиконом в нативном виде показывает более выраженный отек рыхлой неупорядоченной клетчатки (рис. 3).

Группа 1 (имплантируемый материал силикон), 30-сутки после имплантации.

При макроскопическом исследовании наблюдали картину, аналогичную таковой на 14 сутки после имплантации – более выраженную миграцию имплантата в нативном виде без признаков воспаления.

Гистологическая картина в подгруппе L-силикон характеризовалась отсутствием процесса капсулообразо-вания. Вокруг имплантата рыхлая неоформленная ткань. Форменные элементы крови отсутствуют (рис. 4).

В подгруппе R-силикон с богатой тромбоцитами плазмой клетки воспалительного ряда в минимальном количестве. Капсула образуется из коллагеноподобных волокон, за капсулой образовалась рыхлая неупорядоченная соединительная ткань (рис. 5).

Группа 1 (имплантируемый материал силикон), 90-сутки после имплантации.

Рис. 4. Гистологическая картина в подгруппе L-силикон на 30 сутки

Рис. 5. Гистологическая картина в подгруппе R-силикон с богатой тромбоцитами плазмой на 30 сутки

Макроскопический анализ аналогичен предыдущим исследованиям – в обеих подгруппах выраженное смещение имплантата, без признаков воспаления вокруг него.

Гистологическая картина в подгруппе L-силикон – характеризовалась завершением процесса капсулообра-зования. Сформирована плотная многослойная капсула. Окружающие ткани без признаков воспаления (рис. 6).

Во второй подгруппе сформирована тонкая со-единительно-тканная капсула вокруг имплантата. Прилегающие ткани имеют рыхлую структуру с большим количеством сосудов (рис. 7).

Группа 2 (имплантируемый материал «Medpor»), 14-сутки после имплантации.

При макроскопическом исследовании пределяется выраженная воспалительная реакция в подгруппе L-«Por-ex» (3 балла). При комбинации синтетического материала и плазмы отмечена менее выраженная воспалительная реакция (2 балла). Признаков миграции имплантата не отмечено в обеих группах.

При гистологическом исследовании в подгруппе L-«Medpor» наблюдается воспалительный процесс с за- полнением пор материала клетками воспалительного ряда. Вокруг плотной структуры имплантата формируется плотная соединительная ткань.

В подгруппе R-«Medpor» с богатой тромбоцитами плазмой отмечается менее выраженная воспалительная реакция (рис. 8).

Группа 2 (имплантируемый материал «Medpor»), 30-сутки после имплантации.

Признаков воспалительной реакции и смещения имплантата мы не наблюдали в обеих подгруппах.

При микроскопическом исследовании в подгруппе L-«Medpor» процесс капсулообразования как таковой отсутствует. Вокруг имплантата рыхлая неоформленная соединительная ткань (рис. 9).

В подгруппе R-«Medpor» с богатой тромбоцитами плазмой вокруг имплантата сформирована плотная капсула без признаков воспаления. Поры заполнены рыхлыми фибробластами (рис. 10).

Группа 2 Имплантируемый материал «Medpor», 90-сутки после имплантации.

Рис. 6. Гистологическая картина в подгруппе L-силикон на 90 сутки

Рис. 7. Гистологическая картина в подгруппе R-силикон с богатой тромбоцитами плазмой на 90 сутки

Рис. 8. Фото и микроскопическая картина зоны имплантации у животных 2 группы на 14 сутки

Рис. 9. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе L-«Medpor» на 30 сутки

Макроскопическая картина аналогична предыдущему исследованию.

Микроскопически в подгруппе L-«Medpor» видны четкие границы материала с образовавшейся тонкой соединительно-тканной оболочкой. Форменные клетки крови еще присутствуют в ткани (рис. 11).

Во второй подгруппе ткани плотно интегрированы с имплантируемым материалом, поры заполнены рыхлой соединительной тканью. Признаков воспаления не наблюдается (рис. 12).

Группа 3 (имплантируемый материал кость), 14-сутки после имплантации.

Рис. 10. Гистограмма зоны имплантации у животных в подгруппе R-«Medpor» с богатой тромбоцитами плазмой на 30 сутки

Рис. 11. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе L-«Medpor» на 90 сутки

Рис. 12. Гистограмма зоны имплантации у животных в подгруппе R-«Medpor» с богатой тромбоцитами плазмой на 90 сутки

При макроскопическом исследовании отмечена умеренная миграция имплантата в подгруппе L-кость (2 балла), в подгруппе R-кость с богатой тромбоцитами плазмой (1 балл). Признаков воспаления не наблюдалось в обеих подгруппах.

Микроскопически в подгруппе L-кость границ между материалом и тканью нет. В зоне имплантации большое количество гигантских клеток. В подгруппе R-кость с богатой тромбоцитами плазмой зона костного имплантата инфильтрирована форменными элементами крови. Воспалительный процесс умеренной степени. Выраженная нейтрофильная реакция (рис. 13).

Группа 3 (имплантируемый материал кость), 30-сутки после имплантации .

Макроскопическая картина свидетельствует о частичной резорбции имплантатов в обеих подгруппах без признаков воспаления. Миграции имплантатов не определяется.

При гистологическом исследовании в зоне имплантации подгруппы

L-кость наблюдается незавершенный воспалительный процесс, с большим количеством фибробластоподобных клеток, рыхлая ткань чередуется с плотно «упакованными» слоями соединительной ткани (рис. 14).

Во второй подгруппе определяется зона соединения имплантата с окружающей тканью в виде пластов выраженной капсулоподобной ткани. Воспалительный процесс на стадии угасания (рис. 15).

Группа 3 (имплантируемый материал кость), 90-сутки после имплантации.

Макроскопическая картина аналогична предыдущему исследованию.

Гистологическая картина в первой подгруппе характеризуется образованием вокруг костного трансплантата многослойной плотной капсулы инфильтрированной фибробластами без признаков организации соединительной ткани (рис. 16).

Микроскопически в подгруппе R-кость с богатой тромбоцитами плазмой, ткани интегрированы с им-

Рис. 13. Макро и микроскопическая картина зоны имплантации у животных 3 группы на 14 сутки

Рис. 14. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе L-кость на 30 сутки

Рис. 15. Гистограмма зоны имплантации у животных в подгруппе R-кость с богатой тромбоцитами плазмой на 30 сутки

Рис. 16. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе L-кость через 90 дней

плантируемым материалом, поры заполнены рыхлой соединительной тканью.

Признаков воспаления не наблюдается. В зоне заживления просветы сосудов, заполненные форменными элементами крови, что может свидетельствовать об анн-гиогенезе (рис. 17).

Группа 4 (имплантируемый материал хрящ), 14-сутки после имплантации.

Рис. 17. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе R-кость с богатой тромбоцитами плазмой через 90 дней

Признаков воспалительной реакции мы не наблюдали, однако определялось незначительное смещение имплантата слева (2 балла), тогда как комбинация хряща и плазмы ограничивала миграцию имплантата (1 балл).

Микроскопическая картина характеризовалась наличием воспалительной реакции умеренной степени в подгруппе L-хрящ, ткани вдоль имплантата «укладываются» в фибробластоподобные слои.

В подгруппе R-хрящ с богатой тромбоцитами плазмой зона имплантата инфильтрирована форменными элементами крови, определяются признаки воспалительного процесса в умеренной степени, выражена нейтрофильная реакция (рис. 18).

Группа 4 (имплантируемый материал хрящ), 30-сутки после имплантации.

Рис. 18. Макро и микроскопическая картина зоны имплантации у животных 4 группы на 14 сутки

Макроскопическая картина не отличалась от предыдущего исследования.

В подгруппе L-хрящ вдоль имплантата формируется соединительно-тканая капсула с вкраплением гигантских клеток. Ткань вокруг капсулы рыхлая, не дифференцированная (рис. 19).

В подгруппе R-хрящ с богатой тромбоцитами плазмой в зоне соединения имплантата с окружающей тканью визуализируются пласты выраженной капсулоподобной ткани. Воспалительный процесс на стадии угасания (рис. 20).

Группа 4 (имплантируемый материал хрящ), 90-сутки после имплантации.

Макроскопически признаков воспаления нет в обеих подгруппах. Отмечено незначительное смещение имплантатов (1 балл).

Сформирована многослойная рыхлая капсула, имеющая более плотные слои к имплантату в подгруппе L-хрящ (рис. 21).

На 90-е сутки в подгруппе R-хрящ с богатой тромбоцитами плазмой клетки занимали все углубления и дефекты в имплантате (рис. 22).

Таким образом, при оценке макроскопической картины во всех группах животных нами отмечено более стабильное положение имплантируемого материала в комбинации с богатой тромбоцитами плазмой. Резорбцию мы наблюдали только в группе с имплантацией костного материала в обеих подгруппах.

При гистологической оценке состояния имплантатов и реакции окружающих тканей были выявлены:

– низкая степень интеграции к окружающим тканям силикона в обеих подгруппах при минимальной воспалительной реакции окружающих тканей;

– умеренная воспалительная реакция окружающих тканей при имплантации пористого полиэтилена, менее выраженная в комбинации с богатой тромбоцитами плазмой;

– высокая степень интеграции к окружающим тканям пористого полиэтилена;

– потеря структурности обоих вариантов костного имплантата на ранних сроках, что связано с частичной резорбцией костного материала;

– сохранение структурности и отсутствие миграции хрящевого имплантата более выражено в комбинации с богатой тромбоцитами плазмой.

Таким образом, в результате проведенного экспериментального исследования на основании макроскопического анализа и гистологического исследования мы убедились в преимуществах комбинированного использования богатой тромбоцитами плазмы как с синтетическими, так и с биологическими материалами. В этих случаях достигается большая ранняя структурная стабильность комплекса «ткань-имплантат» на фоне менее выраженной воспалительной реакции окружающих тканей.

Рис. 19. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе L-хрящ через 30 дней

Рис. 20. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе R-хрящ с богатой тромбоцитами плазмой через 30 дней

Рис. 21. Гистологическая картина зоны имплантации у животных в подгруппе L-хрящ на 90 сутки

Рис. 22. Гистограмма зоны имплантации у животных в подгруппе R-хрящ с богатой тромбоцитами плазмой через 90 дней