Использование различных углеводов и проявление свойств вирулентности ризобиями сои, обитающими в кубанском черноземе

Введение . В Центральной, Южно-Предгорной и Западной зонах Краснодарского края посевы сои достигают 70–75 и 35,5 тыс. га [3].

Можно полагать, что распространение в изучаемых почвах Bradyrhizobium japonicum , а также, возможно, Rhizobium fredii , обусловлено систематической обработкой посевного материала бактериальными удобрениями инорайонного происхождения. При этом использовались препараты ризобий из ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, с Дальнего Востока, а также из Франции, Канады, Испании, Аргентины, Испании и Бразилии [1; 8]. В такой ситуации в формировании популяции клубеньковых бактерий может участвовать большое количество штаммов (кластеров).

Вместе с тем, по данным Клыкова А.П. [2], Садовского М. [7], Тильбы В.А. [8] появление специфичных ризобий не всегда связано с искусственной модуляцией. Через 4–5 лет после постоянного возделывания сои, вне зависимости от других факторов, в почве может нарастать численность клубеньковых бактерий доминирующей бобовой культуры. Из этого следует, что популяция ризобий сои является достаточно многоплановым образованием и в большинстве случаев представляет собой поликлональную структуру.

Изучение физиолого-биохимического потенциала ризобий сои в кубанских черноземах позволяет прогнозировать активность симбиотической азотфиксации в посевах культуры и потребность воздействия на указанный фактор с помощью бактериальных препаратов. С этой целью было выделено свыше 10 штаммов клубеньковых бактерий, обитающих в изучаемых почвах. Проведено сравнительное исследование их реакции на различные источники углеводов в чистой культуре и проявление вирулентности отдельных штаммов при выращивании растений, корневая система которых находилась в стерильных условиях.

Материалы и методы . Все опыты проводили в лабораторных условиях. Изучались сорта сои Вилана и Славия.

Сорт сои Вилана среднеспелый, созревает за 117–120 суток, содержание белка в семенах 40–41 %, масла – 22–23 %.

Сорт сои Славия – скороспелый, вегетационный период в среднем 98–100 суток, содержание белка 40–41 %, масла – 23–24 %.

Для изучения закономерностей образования клубеньков семена сои стерилизовали концентрированной серной кислотой и промывали стерильной водой. Стерилизованные семена проращивали в чашках Петри на голодном агаре. Для опыта отбирали выровненные стерильные «наклюнувшиеся» семена, которые помещались в пробирки ёмкостью 80 мл, заполненные агаризованной средой Гель-ригеля, не содержащей соединений азота. Одновременно в каждую пробирку вносили 1 мл взвеси чистых культур изучавшихся штаммов клубеньковых бактерий сои (до 1,2 млн клеток в 1 мл).

Всего использовали 9 штаммов ризобий. Из них штаммы 1п, 2п, 3–4п, 7б, 7п, 8п выделены нами из клубеньков сои, выращенной на кубанском выщелоченном черноземе. Штаммы 5/1, 6 и 6/1 выделены из клубеньков сои, выращенной на почвах Амурской области.

При достижении проростками сои верхней кромки пробирки, стебли обкладывали стерильной ватой, и далее корневая система находилась в антисептических условиях. Повторность 6-кратная. Продолжительность опыта 20–23 суток.

Характер роста исследуемых штаммов ри-зобий изучался на питательной среде следующего состава (в граммах на 1 л воды): K 2 HPO 4 – 0,5; KH 2 PO 4 – 0,5; MgSO 4 – 0,1; CaSO 4 – 0,1; NaCl – 0,2; молибденово-кислый аммоний – следы, агар-агар – 20; дрожжевой автолизат – 10 мл. В качестве источника углерода в среду добавляли маннит, галактозу, мальтозу, сахарозу (20 г/л).

Через 2–7 дней учитывали показатели развития колоний (штриха) на косом срезе: интенсивность развития колоний, консистенцию, слизеобразование, появление пузырьков, цветовые оттенки бактериальной массы.

Результаты и обсуждение. При выращивании на различных источниках углерода большинство изучаемых штаммов продемонстрировали интенсивное слизеобразование (табл. 1). Такое свойство нередко присуще клубеньковым бактериям, вступающим в мутуалистические взаимоотношения с бобовыми культурами.

Среди штаммов ризобий сои такое свойство наблюдается как у медленно-, так и у быстрорастущих форм.

Изучаемые нами штаммы 1п, 3–4п и 8п при росте на средах с галактозой, глюкозой и мальтозой не образуют большого количества слизи. В то же время штамм 2п при росте на всех испытывавшихся сахарах и манните продуцировал большое количество этой субстанции.

Табл. 1

Штаммы 7б и 7п слабо росли на средах с галактозой и глюкозой. В остальных вариантах слизеобразование характеризуется как высоко- или среднеинтенсивное.

Штаммы 1п, 7б и 8п при использовании сахаров и маннита слизи не образуют или образуют сравнительно немного.

В отличие от штаммов, выделенных из почв Краснодарского края, ризобии амурского происхождения (5, 6, 6/1) на всех источниках углеводов образуют большое количество слизи.

Темпы образования слизистой массы во многом зависят от степени утилизации углеводов. В этом отношении штаммы амурского происхождения при использовании всех изучавшихся источников энергетического материала (включая дисахара) проявляют высокую интенсивность слизеобразования. Некоторые бактериальные формы, выделенные из кубанского чернозема (штаммы 1п, 7б, 7п и 8п), сравнительно мало слизи образовали в варианте с галактозой. Такое явление обычно присуще медленнорастущим ризобиям [4]. Это же свойственно штамму 3–4п в вариантах с глюкозой, галактозой и мальтозой. Вместе с тем хорошо выраженным данный показатель оказался при использовании сахарозы и маннита.

Штаммы 5/1, 6 и 6/1 изначально отнесены к различным группам по интенсивности роста на плотной питательной среде. Так, форма 5/1 характеризуется как быстроразвивающаяся. Несмотря на это, бактериальные изолянты ризобий, выделенные из почв Приамурья, с высокой интенсивностью использовали все изучавшиеся источники углеводов и образовывали много слизи через 6–7 суток после посева.

Штамм кубанского происхождения 2п давал малозаметный рост на среде с галактозой и демонстрировал высокую интенсивность слизеобразования на других источниках углеводов.

Сахара и маннит, используемые бактериальной клеткой, в первую очередь вовлекаются в интенсивный конституционный рост (включая сопряженные окислительновосстановительные реакции). Различия в темпах образования слизи на изучавшихся источниках углеводов свидетельствуют о заметных штаммовых (физиологических) особенностях анализируемых бактериальных культур. Как указывают Мишустрин Е.Н. и

Шильникова В.К. [4], способность использовать источники углерода во многом определяется физиологией штаммов и может быть связана с особенностями ферментативного комплекса, участвующего в превращении углеводов [5; 6].

Интенсивность образования слизи и окраска колоний изучавшихся культур достаточно однообразна и в основном свойственна типичным показателям ризобий сои. Различия изучаемых свойств позволяют судить об уровне их изменений.

Еще одним показателем пределов изменчивости штаммов может являться свойство вирулентности, определяемое у растений сои, выращенных в условиях с сохранением стерильной корневой системы. В таблице 2 приведены данные о количестве клубеньков и пределы колебаний этого показателя у сортов сои Вилана и Славия в фазе развертывания первого тройчатого листа (среднее из нескольких лабораторных опытов).

Таблица 2

Количество клубеньков, обнаруженных на корнях сои, бактеризированных различными штаммами ризобий при выращивании в антисептических условиях

Ризобии сои	Количество клубеньков в расчете на 1 растение (среднее из 6 опытов)
	сорт Вилана	сорт Славия
1п	3,0 ± 2,0	1,0 ± 0,5
2п	3,0 ± 1,0	5,0 ± 1,4
3–4п	2,0 ± 0,5	12,0 ± 2,3
5/1	1,0 ± 1,0	1,2 ± 0,3
6	2,2 ± 1,5	7,0 ± 1,6
6/1	4,0 ± 1,1	1,0 ± 0,3
7б	4,0 ± 2,1	3,0 ± 1,0
7п	1,0 ± 0,3	6,0 ± 2,1
8п	1,5 ± 0,2	7,0 ± 2,0
Индекс образования клубеньков	2,4 ± 1,2	4,8 ± 1,3

У сорта Славия наибольшее количество клубеньков образовали штаммы 6/1, 7б, 1п и 2п. Невысокую активность в этом процессе проявили ризобии в вариантах с бактериальными культурами 5/1, 7п и 8п. По отношению к сорту Славия максимальные результаты продемонстрировали штаммы 2п, 3–4п, 6 и 8п. Сравнительно мало клубеньков у растений образовались при инокулировании изо-лятами 1п, 5/1 и 6/1.

По индексу образования клубеньков сорт Славия в фазе первого тройчатого листа в 2 раза превосходил сорт Вилана. Объясняется это тем, что первый сорт скороспелый, его вегетационный период составляет 98–100 дней. Поэтому процесс формирования корней и склонность к образованию клубеньков у данного сорта проявляется на первых этапах роста заметнее, чем у среднеспелого сорта Вилана (вегетационный период 117–120 дней).

Указанная закономерность проявляется в рамках свойств каждого штамма. В первую очередь показатель количества клубеньков характеризует вирулентность ризобий. По отношению к сорту Вилана свойство вирулентности в изучаемую фазу изменяется в пределах 1–4 клубенька в расчёте на 1 растение. У сорта Славия этот показатель колеблется от 1 до 12.

Вне зависимости от сортовых особенностей, только два штамма проявили достаточно устойчивые показатели вирулентности (2п и 7б) на первоначальном этапе роста растений. Соответственно по сортам количество клубеньков (в вариантах с указанными штаммами) составляет 3–4 и 3–5 на 1 растение. Штамм 2п характеризуется слабым образованием слизи при выращивании на среде с галактозой и обильным слизеобразованием на всех других источниках углеводов. Штамм 7б на галактозе образует штрих с наибольшим количеством слизи. В других вариантах отмечается аналогичное состояние штриха. Следовательно, штамм 2п по ряду показателей проявляет признаки ускоренно растущего, а штамм 7б – развивающегося замедленно.

При определении вирулентности установлено, что в фазе первого тройчатого листа по отношению к сорту Вилана изучавшиеся штаммы продемонстрировали высокую активность – 90–97 % (табл. 3). У штаммов 1п и 5п в указанной ситуации вирулентность составляла 60 и 63 %.

Таблица 3

Вирулентность клубеньковых бактерий по отношению к сортам сои Вилана и Славия

Сорт	Повтор-ность	Вирулентность штаммов									НСР 05
		1п	2п	3–4п	5/1	6	6/1	7б	7п	8п
Вилана	I	61	88	96	71	89	92	94	98	81	18,95
	II	65	96	88	49	99	96	90	96	99
	среднее	63	93	92	60	94	94	92	97	90
Славия	I	91	96	88	94	98	99	96	97	98	10,15
	II	97	90	98	90	90	95	92	89	94
	среднее	94	93	93	92	94	97	94	93	96

У сорта Славия на первых этапах развития взаимодействие с ризобиями находится на более высоком уровне, и вирулентность составляет 93–97 %. Следует отметить, что у данных сортов образование клубеньков зависит также и от продолжительности светового дня.

Выводы. 1. Штаммы ризобий сои, выделенные из кубанского чернозема при выращивании в агаризованной культуре при различных источниках углевода (галактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза, маннит) образуют хорошо заметный штрих через 3–7 суток после посева. В большинстве случаев ризо-бии формируют крупные слизистые колонии, бесцветные или с матовым, серым оттенком.

• 2.    Штаммы кубанского происхождения 1п, 7б и 8п характеризуются слабым слизеобра-зованием, особенно в вариантах с галактозой и глюкозой. В отличие от аборигенных культур, штаммы, выделенные из почв Амурской области (5/1, 6, 6/1), на всех источниках углеводов росли с образованием большого количества слизи. Бактериальные культуры 1п, 7б и 8п частично проявляют свойства медленно растущих форм. В вариантах со штаммами 3п и 7п слабое слизеобразование наблюдалось при выращивании на среде с галактозой и глюкозой, но бурный рост на среде с сахарозой и маннитом.

• 3.    Выявлены некоторые сортовые различия у растений сои по образованию клубеньков при выращивании корневой системы в стерильных условиях. У сорта Вилана наибольшее количество клубеньков образовывали штаммы 6/1, 7б, 1п и 2п. У сорта Славия максимальным этот же показатель оказался в вариантах с формами 3–4п, 6, 8п. По индексу образования клубеньков в фазе первого тройчатого листа скороспелый сорт Славия в два раза превосходил сорт Вилана.

• 4.    Ризобии, демонстрирующие ограниченный рост на галактозе и, частично, на глюкозе, образуют относительно повышенное количество клубеньков у каждого изучавшего сорта. Исключения составляют штаммы 6 и 6/1.