Использование спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния для поиска фармакодинамических предикторов ответа на антиагрегантную терапию

Несмотря на значительные достижения в профилактике и лечении атеротромбоза, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются наиболее распространенной причиной смерти в мире. Смертность от ССЗ все еще превалирует над другими причинами смертности. Также следует отметить, что 14,5% людей, погибших от ССЗ, относятся к группе трудоспособного возраста [1].

Согласно рекомендациям Российского кардиологического общества, ацетилсалициловая кислота (АСК) 75– 100 мг ежедневно рекомендуется всем пациентам со стабильной ишемической болезнью сердца (ИБС), если она не противопоказана (Класс I, Уровень доказательств А) [2]. В то же время сохраняется проблема недостаточно высо- кого ответа пациентов на терапию антиагрегантными препаратами (АП) [3]. О данной особенности ответа на терапию АП сообщалось у пациентов с сердечно-сосудистыми, цереброваскулярными и периферическими сосудистыми заболеваниями [4, 5]. Метаанализ более 50 исследований показал, что резистентность к АСК и клопидогрелю значительно повышает риск развития больших сердечнососудистых событий (MACE) [6]. По литературным данным, распространенность резистентности к АСК варьирует от 20 до 60% [4, 6, 7]. Резистентность к клопидогрелю, по разным источникам, варьирует от 3 до 65% [6, 8].

В связи с отсутствием единообразного подхода актуальным является разработка и валидация предиктивных биомаркеров для повышения эффективности и безопасности терапии с использованием АП.

Большая часть лабораторных методов исследования функции тромбоцитов измеряет сложные процессы, которые в конечном итоге приводят к агрегации или адгезии тромбоцитов [9]. Наиболее часто используемыми методами для изучения антитромбоцитарных эффектов АСК являются методы оценки неспецифической функции тромбоцитов, такие как агрегометрия светопропускания или агрегометрия цельной крови [10]. Однако оценка тромботического статуса на основе реакции тромбоцитов только на одного или двух агонистов игнорирует сложность механизма образования тромбов in vivo, и полученные в ходе исследований лабораторные данные не всегда коррелируют с клиническими исходами.

Цель данного исследования: изучить возможности применения метода гигантского комбинационного рассеяния света (ГКРС) для поиска фармакодинамических биомаркеров, позволяющих прогнозировать ответ пациентов на антиагрегантную терапию (АТ) и возможности персонализации терапии.

Материал и методы

Субъекты исследования. В исследовании приняли участие здоровые добровольцы и пациенты с ССЗ. Протокол проведения исследования был одобрен Независимым этическим комитетом (выписка из протокола заседания № 8 от 16.05.2019 г.). Все субъекты исследования подписали 2 экземпляра информированного согласия до проведения всех процедур, предусмотренных исследованием.

У всех субъектов исследования была проведена оценка факторов сердечно-сосудистого риска. К факто- рам сердечно-сосудистого риска отнесены: мужской пол, возраст старше 55 лет у мужчин и старше 65 лет у женщин, менопауза, наследственная отягощенность по ССЗ, сахарный диабет, курение, дислипидемия, артериальная гипертензия, избыточная масса тела и ожирение, употребление алкоголя. Функциональный класс хронической сердечной недостаточности был определен по тесту дистанции ходьбы за 6 мин.

Общее количество обследованных субъектов составило 152. Субъекты были разделены на 4 группы (табл. 1), это позволило более точно стратифицировать обследованных и использовать клинические данные: группа 1 – здоровые добровольцы без ССЗ (SCORE < 1%), без приема каких-либо АП и любых нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) в течение предыдущих 7 дней; группа 2 – здоровые добровольцы без ССЗ (SCORE < 1%) , получавшие АСК в дозе 100 мг 1 раз в сутки в течение 1–3 дней; группа 3 – пациенты, страдающие ССЗ (SCORE 5–10% и более 10%), без приема АП или НПВП в течение предыдущих 7 дней; группа 4 – пациенты, страдающие ССЗ (SCORE 5–10% и более 10%), получающие стабильную терапию АП (АСК – 75–100 мг 1 раз в сут 7 дней или более, клопидогрел – 75 мг 1 раз в сут 7 дней или более). В группу 3 были включены пациенты с артериальной гипертензией и атеросклерозом, которые не получают терапию антиагреганта-ми, но имеют высокий и очень высокий 10-летний сердечно-сосудистый риск. В группу 4 вошли пациенты с ИБС и перенесенным острым коронарным синдромом (ОКС).

Таблица 1. Клинико-анамнестические характеристики субъектов, включенных в исследование

Table 1. Clinical and anamnestic characteristics of subjects included in the study

Характеристика Characteristic	Группа 1 Group 1	Группа 2 Group 2	Группа 3 Group 3	Группа 4 Group 4
Количество субъектов, n Number of subjects, n	36	15	41	60
Возраст, лет, Me ( Q 25; Q 75) Age, years, Me ( Q 25; Q 75)	22,3 (20; 35)	28 (21; 45)	65 (56; 82)	67 (51; 81)
Женщины, n (%) Women, n (%)	21 (58)	9 (60)	31 (76)	48 (80)
Мужчины, n (%) Men, n (%)	15 (42)	6 (40)	10 (24)	12 (20)
Прием АСК, n (%) ASA* intake, n (%)	0 (0)	15 (100)	0 (0)	60 (100)
Прием клопидогреля, n (%) Clopidogrel intake n (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	15 (25)
SCORE**, Me ( Q 25; Q 75)	0,8 (0,6; 0,98)	0,8 (0,7; 0,9)	10,8 (5,2; 25,1)	9,7 (5,8; 17,2)
Шкала глобальной оценки 10-летнего сердечно-сосудистого риска Global 10-Year Cardiovascular Risk Scale	–	–	Высокий и очень высокий High and very high	Высокий и очень высокий High and very high

Примечание: Ме – медиана, Q ₂₅ – 25-й процентиль, Q ₇₅ – 75-й процентиль.

Note: Me – median, Q ₂₅ – 25 ^th percentile, Q ₇₅ – 75_th percentile. *ASA – acetylsalicylic acid, ** SCORE – Systematic Coronary Risk Evaluation

Оценку риска, согласно шкале SCORE, проводили в зависимости от пола, возраста, статуса курения, систолического артериального давления и концентрации общего холестерина [12].

Биообразцы. Для исследования тромбоцитов с помощью ГКРС образцы свежей венозной крови были взяты у здоровых добровольцев и пациентов с ССЗ в вакуумную пробирку, содержащую ЭДТА (BD Vacutainer®).

Далее образцы центрифугировали при 60g в течение 15 мин для отделения богатой тромбоцитами плазмы, затем ее второй раз центрифугировали при 60g в течение 15 мин для осаждения лейкоцитов и эритроцитов. На последнем этапе тромбоциты были осаждены путем центрифугирования супернатанта при 1500g в течение 15 мин. Все этапы центрифугирования были проведены при 4 °C.

Образцы свежей венозной крови для проведения агрегометрии были взяты в вакуумную пробирку, содержащую цитрат натрия (Vacutainer 4,5 мл с цитратом натрия 3,2%®). Далее пробирки с забранным материалом экспозировались при комнатной температуре в течение 1,5–3 ч. Затем 800 мкл крови загружались в картридж анализатора.

Агрегометрия. Методом сравнения была выбрана агрегометрия с использованием системы PFA-200 (Siemens, Германия), ключевой особенностью которой является имитация условий in vivo . Преимуществами данной системы являются использование цельной крови, картриджная система, быстрота получения результата, легкая интерпретация [13]. Технология, используемая в приборе PFA-200, — моделирование процесса адгезии и агрегации тромбоцитов, возникающих в поврежденном сосуде [13, 14].

Анализ был поведен с тремя видами картриджей: 1. Картридж, содержащий в качестве активатора коллаген с эпинефрином (Collagen/EPI). 2. Картридж, содержащий коллаген с АДФ (Collagen/ADP). 3. Картридж, содержащий простагландин Е1 (P2Y).

Рис. 1. Используемые для получения ГКРС*-спектров тромбоцитов наноструктурированные титановые поверхности, модифицированные золотыми наночастицами. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии. Собственные неопубликованные данные авторов

* ГКРС - гигантское комбинационное рассеяние света

Fig. 1. Nanostructured titanium surfaces modified with gold nanoparticles used to obtain SERS** spectra of platelets. The image was obtained by scanning electron microscopy. Authors’ own unpublished data

** SERS - surface-enhanced Raman spectroscopy

Изучение тромбоцитов с помощью метода ГКРС. Для получения спектров ГКРС использовался спектрометр Centaur U HR со спектральным разрешением 2,5 см^–1. Образцы тромбоцитов помещались на модифицированные фемтосекундным лазером титановые поверхности. Такие поверхности обеспечивали эффект плазмонного усиления вблизи поверхности структуры и состояли из наноструктурированного титана с нанесенным аблационным золотом (рис. 1).

На титановые поверхности наносили каплю образца объемом 5 мкл, высушивали в течение 5 мин при комнатной температуре, далее образец помещался на держатель микроскопа. Оптическое изображение тромбоцитов на титановой поверхности изображено на рисунке 2А. Для съемки был использован DPSS-лазер с длиной волны λ = 532 нм. Лазерный луч фокусировался на образце вручную с помощью USB-видеокамеры и механической системы позиционирования. Размер лазерного пятна варьировался от 1 × 10 до 1 × 25 мкм в зависимости от используемой мощности лазера. Спектры комбинационного рассеяния регистрировали в диапазоне волновых чисел «отпечатка пальца» от 400 см–1 до 1800 см–1. Для обработки полученных спектров использовалась информационная система BioRad-Know It All (Willey, UK). Для расшифровки спектров и оценки изменений в них использовалась ручная расшифровка по колебательным группам, а также литературные данные. Пример спектра изображен на рисунке 2Б.

Рис. 2. Оптическое изображение тромбоцитов на титановой поверхности (A) и (Б) характерный ГКРС*-спектр тромбоцита периферической крови пациента из группы 4. Собственные неопубликованные данные авторов

* ГКРС - гигантское комбинационное рассеяние света

Fig. 2. Optical image of platelets on a titanium surface (A) and (Б) characteristic SERS** spectrum of a patient’s peripheral blood platelet from group 4. Authors’ own unpublished data

** SERS - surface-enhanced Raman spectroscopy

Статистическая обработка данных была выполнена с использованием программного пакета STATISTICA 13.3. Основным объектом для поиска потенциальных предиктивных биомаркеров являлись совокупности значений максимумов ГКРС-спектров тромбоцитов, соответствующих определенным частотным сдвигам (ЧС). Каждая выборка перед проведением статистического анализа была проверена на нормальность тестом Шапиро – Уилка (p > 0,05). Принимая во внимание, что все выборки соответствовали условиям нормального распределения, в качестве метода сравнения средних значений выборок был использован t-критерий Стьюдента для независимых переменных.

Для проведения корреляционного анализа был применен метод Пирсона, реализованный в функции «прямоугольная матрица корреляции» программного пакета STATISTICA 13.3. Для проверки статистических гипотез была использована поправка Бонферрони ( p < 0,05/m, где m – проверяемое число гипотез).

Результаты

Ранее с использованием процедур машинного обучения нами были определены ЧС ГКРС-спектров тромбоцитов периферической крови, имеющие наибольшую информативность при выявлении различий в спектрах здоровых пациентов и пациентов с ССЗ, а также для оценки фармакодинамических эффектов антитромбоци-тарных препаратов. В списке наиболее перспективных для последующего изучения ЧС было выбрано 21 значение, а именно – 420, 430, 485, 505, 605, 615, 720, 805, 955, 960, 970, 975, 980, 990, 1040, 1400, 1410, 1465, 1535, 1540, 1590 см-1 [15].

При сравнении средних значений интенсивностей ГКРС-спектров тромбоцитов, полученных для разных групп субъектов исследования, были выявлены значи- мые различия. Между спектрами тромбоцитов здоровых добровольцев и пациентов, страдающих ССЗ (группа 1 и группа 3), значимые различия были установлены для всех значений ЧС: 420, 430, 485, 505, 605, 615, 720, 805, 955, 960, 970, 975, 980, 990, 1040, 1400, 1410, 1465, 1535, 1540, 1590 см-1 (табл. 2). Абсолютная разница средних значений интенсивностей ГКРС-спектров колебалась от 2890 до 9521, при этом максимальные различия были получены для ЧС 505 и 990 см-1.

Сопоставление средних значений интенсивностей ГКРС-спектров тромбоцитов здоровых добровольцев, получавших (группа 2) и не получавших АСК (группа 1), выявило статистически значимые отличия для следующих трех ЧС: 505, 990, 1465 см-1. При этом для ЧС 505, 1465 см-1 отмечались максимальные различия средних значений интенсивностей ГКРС-спектров – 2142 и 2054 (см. табл. 2).

Установлено, что существуют статистически значимые различия средних значений интенсивностей ГКРС-спек-тров для четырех ЧС 485, 505, 990, 1465 см-1 (см. табл. 2). Для перечисленных ЧС также выявлены наибольшие различия в средних по абсолютным значениям – 1904, 2195, 3328, 2690. Интересно, что разница средних значений интенсивностей ГКРС-спектров тромбоцитов для групп 3 и 4 варьировала для разных ЧС не только по абсолютным значениям, но и по знаку. Так, для ЧС 505 и 990 см-1 разница средних составила –2195 и –3328, а для ЧС 485 и 1465 см-1 – 1904 и 2690 соответственно.

Таблица 2. Сравнение интенсивностей ГКРC*-спектров тромбоцитов периферической крови, полученных на разных значениях частотных сдвигов в разных группах

Table 2. Comparison of the intensities of SERS** spectra of peripheral blood platelets obtained at different values of frequency shifts in different groups

Частотный сдвиг, см -1 Frequency shift, cm -1	Группа 1 M ( S ), n = 385 Group 1 M (S ), n = 385	Группа 2 M ( S ), n = 126 Group 2 M (S), n = 126	Группа 3 M ( S ), n = 407 Group 3 M (S), n = 407	Группа 4 M ( S ), n = 348 Group 4 M (S) , n = 348
420	10173 (408)	8911 (416)	14986 (582) *	14958 (664)
430	10160 (409)	8895 (419)	14963 (582) *	14940 (665)
485	10255 (415)	8954 (423)	13499 (587) *	15403 (674)
505	10427 (419)	8285 (426) "	17553 (591) *	15358 (678)
605	10508 (430)	9138 (440)	15386 (599) *	15539 (689)
615	10573 (432)	9175 (440)	15454 (601) *	15622 (691)
720	10970 (442)	9486 (452)	15844 (610) *	16155 (703)
805	11220 (457)	9670 (471)	16255(626 ) *	16588 (722)
955	12973 (498)	11328 (526)	18344 (682) *	18783 (775)
960	12941 (499)	11307 (528)	18309 (682) *	18759 (776)
970	12820 (497)	11174 (528)	18196 (681) *	18671 (777)
975	12818 (497)	11152 (527)	18226 (681) *	18713 (778)
980	12907 (498)	11198 (528)	18379 (685) *	18871 (782)
990	13660 (509)	11891 (548) "	23181 (705) *	19853 (798)
1040	12962 (500)	11248 (532)	18191 (682) *	18710 (777)
1400	13460 (549)	11653 (583)	18924 (721) *	19561 (815)
1410	13479 (548)	11664 (589)	18940 (720) *	19564 (814)
1465	14261 (555)	12207 (590)	17151 (727) *	19841 (815)
1535	14229 (586)	12650 (686)	19376 (743) *	19880 (831)
1540	13837 (572)	12054 (648)	19012 (735) *	19598 (828)
1590	13205 (562)	11341 (594)	18592 (724) *	19299 (822)

Примечание: n – количество спектров, M – среднее арифметическое, S – стандартная ошибка среднего арифметического. Значение вероятности нулевой гипотезы равенства средних арифметических с использованием непарного t - критерия Стьюдента p < 0,017 при сравнении: * – группы 1 и группы 2, – группы 3 и группы 4, # – группы 1 и группы 3. * ГКРС – гигантское комбинационное рассеяние света

Note: n is the number of spectra, M is the arithmetic mean, S is the standard error of the arithmetic mean. The probability value of the null hypothesis of equality of arithmetic means using unpaired Student’s t- tes t p < 0.017 when comparing: * – groups 1 and groups 2, – groups 3 and groups 4, # – groups 1 and groups 3. ** SERS - surface-enhanced Raman spectroscopy

Корреляционный анализ для выявления потенциальных биологических механизмов, лежащих в основе выявленных спектральных различий, выполнили для всех значений интенсивностей ГКРС-спектров (всех групп пациентов) и показателей агрегометрии. Количество полу- ченных значений коэффициентов корреляции составило более 10 000, поэтому для упрощения анализа мы приводим только диапазоны коэффициентов корреляций, сгруппированных для разных категорий пациентов и разных методов изучения агрегации тромбоцитов (табл. 3).

Таблица 3. Диапазоны коэффициентов корреляции между интенсивностями ГКРC*-спектров тромбоцитов периферической крови и параметрами агрегации тромбоцитов, полученных с использованием разных картриджей системы PFA***-200

Table 3. Ranges of correlation coefficients between the intensities of SERS** spectra of peripheral blood platelets and the parameters of platelet aggregation obtained using different cartridges of the PFA***–200 system

Группы пациентов Patient groups	Диапазон коэффициентов корреляции, min-max ( Me ) Correlation coefficient range, min-max (Me )
	Coll/ADP****	Coll/Epi*****	P2Y******
Все группы All groups	0,05 ... 0,07 (0,06)	0,07 ... 0,1 (0,09)	0,31 ... 0,33 (0,32)*
Группа 1 Group 1	–0,3 ... –0,16 (–0,23)	–0,32 ... –0,17 (–0,24)	–0,12 ... –0,06 (–0,09)
Группа 2 Group 2	–0,93 ... –0,75 (–0,84)*	–0,51 ... –0,18 (–0,34)	–0,51 ... –0,18 (–0,34)
Группа 3 Group 3	–0,13 ... –0,06 (–0,09)	–0,16 ... –0,09 (–0,12)	0,16 ... 0,19 (0,18)
Группа 4 Group 4	–0,06 ... 0,09 (0,02)	0,13 ... 0,15 (0,140)	0,47 ... 0,52 (0,5)*

Примечание: min – минимальное значение коэффициента корреляции, max – максимальное значение коэффициента корреляции, Ме – медиана, * – наличие достоверных значений коэффициентов корреляции, p < 0,008. * ГКРС – гигантское комбинационное рассеяние света

Note: Min – the minimum value of the correlation coefficient, Max – the maximum value of the correlation coefficient, Me – median, * – the presence of significant values of the correlation coefficients, p < 0.008.

** SERS - surface-enhanced Raman spectroscopy *** PFA - platelet function analyzer **** Coll/ADP - Collagen/ADP ***** Coll/Epi - Collagen / Epinephrine ******P2Y – картридж, содержащий простагландин Е1

При проведении корреляционного анализа ГКРС-спек-тров тромбоцитов разных групп и результатов агрегоме-трии для некоторых групп были выявлены статистически значимые корреляции (см. табл. 3). При рассмотрении данных корреляционного анализа видно, что ГКРС-спек-тры тромбоцитов здоровых добровольцев, получающих АСК (группа 2), имеют статистически значимую высокую отрицательную корреляцию ( r = –0,93…–0,75; p < 0,008) с результатами агрегометрии при воздействии активатора Coll/ADP, представленными в секундах (см. табл. 3).

В свою очередь суммарно ГКРС-спектры всех участников исследования (группы 1, 2, 3, 4) имеют слабую положительную связь ( r = 0,305–0,328) с результатами агрегометрии в секундах с использованием картриджа с активатором P2Y. ГКРС-спектры тромбоцитов пациентов с ССЗ, получающих терапию АСК, также коррелируют с результатами агрегометрии в секундах с использованием картриджа с активатором P2Y и показывают среднюю положительную связь ( r = 0,472–0,521).

Обсуждение

Биохимические механизмы различных фаз активации тромбоцитов – адгезии, изменения формы, реакции высвобождения и агрегации – хорошо описаны, однако полное отражение этих сложных процессов в лабораторные методы не выполнено [16]. В связи с большой распространенностью применения АП в клинической практике существует потребность оценки эффективности терапии этим классом препаратов у значительной когорты пациентов.

Метод ГКРС-спектроскопии обладает преимуществами, делающими его перспективным диагностическим подходом для использования в клинической практике [17]. ГКРС позволяет быстро и точно получать информацию о биологической структуре объекта в режиме реального времени с использованием минимальной пробо-подготовки [17]. Одними из основных преимуществ ГКРС являются высокая специфичность и возможность относительно простого масштабирования данного метода с лабораторного прототипа в портативные устройства для диагностики на месте оказания медицинской помощи – Point-of-care testing (POCT) [18].

На сегодняшний день количество работ, описывающих использование спектроскопии ГКРС для изучения форменных элементов крови, ограничено, и единые подходы к применению данного метода пока не разработаны [19].

Обнаруженные спектральные различия тромбоцитов здоровых добровольцев и пациентов с ССЗ ожидаемы, поскольку ранее исследователи уже сообщали о структурных и функциональных изменениях тромбоцитов, обнаруженных у пациентов с ССЗ [20].

Одним из самых сложных аспектов использования спектроскопии ГКРС является выделение наиболее информативных участков среди большого количества данных, получаемых при снятии ГКРС-спектров. С использованием процедур машинного обучения нами были определены ЧС ГКРС-спектров тромбоцитов периферической крови, имеющие наибольшую информативность при выявлении различий в спектрах здоровых добровольцев и пациентов с ССЗ, а также для оценки фармакодинамических эффектов АП. Результаты, представленные в настоящей статье, показывают, что анализ интенсивностей ГКРС-спектров тромбоцитов на всех перечисленных выше ЧС достовер- но отличается в группах здоровых лиц и пациентов с ССЗ. Таким образом, все вышеперечисленные ЧС являются потенциальными кандидатами для использования в методиках диагностики ССЗ и для создания соответствующих диагностических приборов (см. табл. 2).

Наиболее вероятным объяснением найденных различий, на наш взгляд, является отличие химического состава мембран тромбоцитов у здоровых лиц и пациентов с

ССЗ, которые определяют наличие структурных и функциональных изменений тромбоцитов, имеющих место у пациентов с ССЗ [20]. Это подтверждается проведенным нами ранее сопоставлением ГКРС-спектров тромбоцитов здоровых лиц и пациентов с ССЗ по наличию четких отличий в содержании амидных групп, триптофана, серина, по изменениям в структуре белков для групп Амид I, S-S связей низкочастотной области (рис. 3) [15].

Рис. 3. Спектральные различия химического состава тромбоцитов здоровых в низкочастотном диапазоне длин волн для пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и здоровых добровольцев: сопоставление ГКРС*-спектров тромбоцитов. Ранее опубликованные данные [15]

* ГКРС – гигантское комбинационное рассеяние света

Fig. 3. Spectral differences in the chemical composition of healthy platelets in the low-frequency wavelength range for patients with CVD*** and healthy volunteers: comparison of SERS** spectra of platelets. Previously published data [15]

** SERS - surface-enhanced Raman spectroscopy *** CVD – cardiovascular diseases

В то же время основной задачей нашего исследования было обнаружить с помощью спектроскопии ГКРС тромбоцитов потенциальные биомаркеры у пациентов, получающих терапию АП, которые бы позволили изучать фармакодинамические эффекты этих препаратов. В этой связи наибольший интерес представляли различия ГКРС-спектров между здоровыми лицами, получавшими и не получавшими АСК (группа 1 и группа 2), а также пациентами с ССЗ, получавшими и не получавшими терапию АП (группа 3 и группа 4). Нами были выявлены статистически значимые различия по некоторым интенсивностям ГКРС-спектров тромбоцитов у добровольцев и пациентов с ССЗ, получающих терапию АСК и без терапии АСК только для четырех ЧС, а именно – 485, 505, 990, 1465 см-1 (см. табл. 2).

Для того чтобы определить, с каким классом АП в большей степени коррелируют выявленные нами спектральные различия тромбоцитов, был проведен корреляционный анализ между интенсивностями ГКРС-спек-тров тромбоцитов периферической крови и параметрами агрегации тромбоцитов, полученных с использованием разных картриджей системы PFA-200. Были выявлены достоверные корреляции: между ГКРС-спектрами здоровых добровольцев, получающих АСК (группа 2), и результатами агрегометрии при воздействии активатора Coll/ ADP; между ГКРС-спектрами всех участников (группы 1, 2, 3, 4) и результатами агрегометрии при воздействии активатора P2Y; между ГКРС-спектрами тромбоцитов паци- ентов с ССЗ, получающих терапию АСК, и результатами агрегометрии при воздействии активатора P2Y. Наличие данных корреляций свидетельствует о связи изменения структуры мембраны с функциональной активностью тромбоцита.

Несколько неожиданным оказался факт отсутствия достоверных корреляционных связей между ГКРС-спек-трами пациентов с ССЗ, получающими АСК (группа 4), и результатами агрегометрии при воздействии активатора Coll/ADP. Возможно несколько вероятных объяснений данному факту. Во-первых, можно предположить, что у части пациентов имела место низкая комплаентность к терапии АСК (для сравнения: пациенты из группы 2 принимали АСК в центре под контролем исследователей). Во-вторых, у части пациентов группы 4 могла развиться резистентность к действию АСК. В-третьих, возможно, статистическая мощность исследования оказалась недостаточной в силу относительно небольшого числа пациентов в группе или большой гетерогенности пациентов. Для прояснения описанного несоответствия нами планируется проведение исследований с контролем приема АСК, более жесткими критериями включения пациентов и исключения пациентов с риском резистентности к АСК.

Выводы

• 1.    Метод ГКРС-спектроскопии с использованием оптического сенсора, выполненного на основе наноструктури-рованных золотыми частицами титановых поверхностей,

  может быть использован для диагностики состояния тромбоцитов. Получен патент РФ № RU 2022108969/28 (018713).

• 2.    Для диагностики функционального состояния тромбоцитов у пациентов с ССЗ перспективными являются значения интенсивностей ГКРС-спектров на частотах – 420, 430, 485, 505, 605, 615, 720, 805, 955, 960, 970, 975, 980, 990, 1040, 1400, 1410, 1465, 1535, 1540, 1590 см^-1.

• 3.    Для изучения фармакодинамических эффектов АП

  наиболее подходящими являются значения интенсивностей ГКРС-спектров на ЧС – 485, 505, 990, 1465 см^–1.

• 4.    Выявленные спектральные изменения тромбоцитов периферической крови у пациентов с ССЗ коррелируют с изменениями агрегометрии, полученными при использовании картриджа с активатором P2Y, что обосновывает использование метода ГКРС-спектроскопии прежде всего для оценки фармакодинамических эффектов ингибиторов P2Y12 рецепторов.